一种中国仓鼠卵巢细胞外泌体的提取方法及其应用技术

本发明专利技术提供了一种中国仓鼠卵巢细胞外泌体的提取方法及其应用，属于基因工程技术领域。本发明专利技术采用差速超速离心法提取中国仓鼠卵巢细胞的外泌体，通过简单操作可以获得高产量、高纯度的外泌体，将该外泌体作为细胞培养基补充添加剂，能够提高重组蛋白的表达水平，提高重组蛋白药物的生产效率和经济效益。提高重组蛋白药物的生产效率和经济效益。提高重组蛋白药物的生产效率和经济效益。

【技术实现步骤摘要】
一种中国仓鼠卵巢细胞外泌体的提取方法及其应用


[0001]本专利技术涉及基因工程
，尤其涉及一种中国仓鼠卵巢细胞外泌体的提取方法及其应用。

技术介绍

[0002]哺乳动物细胞表达平台是生产治疗性重组蛋白药物的主要系统，中国仓鼠卵巢细胞(Chinesehamsterovary,CHO)因其具备蛋白折叠和翻译后修饰功能，既可贴壁生长，也可悬浮培养，具有高效的基因扩增和表达能力，已经成为生物制药重要的表达和生产系统，并广泛应用于抗体、基因重组蛋白药物和病毒疫苗等产品的研发和工业化生产中。在生物制药工业中，开发细胞培养基和优化培养条件是获得高产量和高质量重组蛋白药物的关键。
[0003]外泌体是由不同细胞分泌的直径为30～150nm的细胞外脂质双层囊泡，含有蛋白质、核酸、脂质和miRNA等，不仅能够调节细胞生物学活性，还参与细胞间通讯和机体的生理代谢过程。研究表明，外泌体能够调控包括炎症、细胞分化和细胞凋亡等一系列生物学活动。然而目前，对外泌体的应用更多的体现在医学
，例如，将外泌体用于高血压及相关疾病的诊断，用于烧伤、皮肤溃疡、创伤等受损皮肤的修复治疗，用于改善肤质、修复衰老中毒皮肤等。尚未见将外泌体添加到细胞培养基的相关研究。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的在于提供一种中国仓鼠卵巢细胞外泌体的提取方法及其应用。本专利技术采用差速超速离心法提取中国仓鼠卵巢细胞的外泌体，通过简单操作可以获得高产量、高纯度的外泌体，将该外泌体作为细胞培养基补充添加剂，能够提高重组蛋白的表达水平，提高重组蛋白药物的生产效率和经济效益。
[0005]为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供了以下技术方案：
[0006]本专利技术提供了一种中国仓鼠卵巢细胞外泌体在提高重组蛋白表达水平中的应用。
[0007]优选的，所述提高重组蛋白表达水平的方法为，将所述中国仓鼠卵巢细胞外泌体作为培养基补充添加剂，培养表达重组蛋白的细胞。
[0008]优选的，所述中国仓鼠卵巢细胞外泌体在培养基中的终浓度为(5～10)
×
105particles/mL。
[0009]本专利技术还提供了一种上述中国仓鼠卵巢细胞外泌体的提取方法，包括如下步骤：
[0010](1)使用基础培养基培养中国仓鼠卵巢细胞，待细胞密度达到70～90％时消化细胞，将细胞转移至条件培养基中培养2～3天后，收集细胞培养上清液；
[0011](2)将步骤(1)收集的细胞培养上清液于0～4℃下，200～400g离心8～12min，以去除细胞沉淀后，收集上清液；
[0012](3)将步骤(2)收集的上清液于0～4℃下，1500～2500g离心8～12min，以去除死细胞后，收集上清液；
[0013](4)将步骤(3)收集的上清液于0～4℃下，9000～12000g离心20～40min，以去除细
胞碎片后，收集上清液；
[0014](5)将步骤(4)收集的上清液过滤以去除细胞微粒后，收集上清液；
[0015](6)将步骤(5)收集的上清液于0～4℃下，70000～150000g离心60～80min，以去除杂蛋白后，收集沉淀；
[0016](7)用PBS洗涤步骤(6)收集的沉淀，70000～150000g离心60～80min，弃上清，得到所述中国仓鼠卵巢细胞外泌体。
[0017]优选的，所述中国仓鼠卵巢细胞为CHO
‑
S细胞或CHO
‑
K1细胞。
[0018]优选的，所述基础培养基为包含血清的DMEM/F12培养基；所述血清在所述基础培养基中的体积分数为8～12％。
[0019]优选的，所述条件培养基为包含无外泌体血清的DMEM/F12培养基；所述无外泌体血清在所述条件培养基中的体积分数为8～12％。
[0020]优选的，所述转移的细胞与所述条件培养基的比例为2
×
106个：8～15mL。
[0021]优选的，所述过滤为使用0.2～0.4μm微孔滤膜过滤。
[0022]本专利技术提供了一种中国仓鼠卵巢细胞外泌体的提取方法及其应用。本专利技术采用差速超速离心法提取中国仓鼠卵巢细胞的外泌体，逐步去除细胞沉淀、死细胞、细胞碎片后，通过过滤去除细胞微粒，再进行离心去除杂蛋白，从而可以提高外泌体产率及纯度。本专利技术的提取方法操作简便、外泌体产量高，提取得到的中国仓鼠卵巢细胞外泌体作为培养基补充添加剂，能够显著提高重组蛋白的表达水平，提高重组蛋白药物的生产效率，提高经济效益。
附图说明
[0023]图1为实施例1提取的中国仓鼠卵巢细胞外泌体的形态结构图。
[0024]图2为对比例1提取的中国仓鼠卵巢细胞外泌体的形态结构图。
[0025]图3为实施例1提取的中国仓鼠卵巢细胞外泌体的浓度与粒径分布图。
[0026]图4为实施例1提取的中国仓鼠卵巢细胞外泌体标志蛋白的Westernblot检测结果图。
[0027]图5为试验例3中不同浓度的中国仓鼠卵巢细胞外泌体作用下的重组蛋白HSA表达水平。
具体实施方式
[0028]下面结合实施例对本专利技术提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本专利技术保护范围的限定。
[0029]实施例1
[0030]本实施例提供了一种中国仓鼠卵巢细胞外泌体的提取方法，具体过程如下：
[0031](1)使用超高速离心机将常规胎牛血清(购自维森特生物技术有限公司，货号086
‑
150)在4℃、100000g条件下离心12h，0.2μm滤膜过滤，得到无外泌体血清；
[0032](2)将90％的DMEM/F12培养基与10％的常规胎牛血清混合，制成基础培养基；将90％的DMEM/F12培养基与10％的无外泌体血清混合，制成条件培养基；用基础培养基培养中国仓鼠卵巢细胞CHO
‑
S细胞(购自Gibco公司)，待细胞密度达到80％时消化细胞，按照2
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106细胞/皿的密度接种到10cm细胞培养皿中，使用10mL的条件培养基培养细胞3天，收集细胞培养上清液；
[0033](3)将步骤(2)收集的细胞培养上清液于4℃下，300g离心10min以去除细胞沉淀，收集上清液；
[0034](4)将步骤(3)收集的上清液于4℃下，2000g离心10min以去除死细胞，收集上清液；
[0035](5)将步骤(4)收集的上清液于4℃下，10000g离心30min以去除细胞碎片，收集上清液；
[0036](6)将步骤(5)收集的上清液采用0.22μm的微孔滤膜过滤，以去除细胞微粒，收集上清液；
[0037](7)将步骤(6)收集的上清液于4℃下，100000g离心70min以去除杂蛋白，收集沉淀；
[0038](8)用PBS洗涤步骤(7)收集的沉淀，100000g离心70min，弃上清，得到中国仓鼠卵巢细胞外泌体。
[0039]本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种中国仓鼠卵巢细胞外泌体在提高重组蛋白表达水平中的应用。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述提高重组蛋白表达水平的方法为，将所述中国仓鼠卵巢细胞外泌体作为培养基补充添加剂，培养表达重组蛋白的细胞。3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述中国仓鼠卵巢细胞外泌体在培养基中的终浓度为(5～10)
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105particles/mL。4.一种权利要求1～3任一项中所述的中国仓鼠卵巢细胞外泌体的提取方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)使用基础培养基培养中国仓鼠卵巢细胞，待细胞密度达到70～90％时消化细胞，将细胞转移至条件培养基中培养2～3天后，收集细胞培养上清液；(2)将步骤(1)收集的细胞培养上清液于0～4℃下，200～400g离心8～12min后，收集上清液；(3)将步骤(2)收集的上清液于0～4℃下，1500～2500g离心8～12min后，收集上清液；(4)将步骤(3)收集的上清液于0～4℃下，9000～12000g离心20～40min后，收集上清液；(5)将步骤(4)收集的上清液过滤，收集...

【专利技术属性】
技术研发人员：张玺，王天云，王耀坤，孙秋丽，耿少雷，王小引，贾岩龙，张俊河，韩明明，王浩民，
申请(专利权)人：新乡医学院，
类型：发明
国别省市：