【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于生物合成乳制品的活细胞构建体、及其相关产品和方法
[0001]本专利技术涉及活细胞构建体，及使用该活细胞构建体以在体外和/或间接体外从培养的乳腺细胞中生产乳汁的方法。
技术介绍
[0002]乳汁是婴儿时期和整个生命中人类的主要饮食。美国儿科学会(American Academy of Pediatrics)和世界卫生组织(World Health Organization)建议，婴儿出生后的6个月应当完全母乳喂养，婴儿之后食用的乳制品是人类营养的主要来源，这代表着全球7000亿美元的产业。然而，哺乳是一个生理需求和代谢密集的过程，这可能会给哺乳的母亲带来生物学和实践上的挑战，而在农业环境下，乳制品与环境、社会、和动物保护相关。
[0003]近年来，利用哺乳动物细胞培养来生产食物的可能性获得了越来越多的兴趣，通过培养肌肉和脂肪细胞成功开发出几种肉类食品和海洋食品的原型(Stephens等人，2018年，食品科技的趋势(Trends Food Sci Technol)，78:155
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166)。此外，正在努力利用微生物表达系统使鸡蛋和乳蛋白的生产商业化。然而，这种以发酵为基础的方法依赖于单个成分的基因工程表达和纯化，且无法重现乳汁或乳制品的完整分子图谱。
[0004]本专利技术通过提供活细胞构建体及使用该活细胞构建体来以在体外和/或间接体外从培养的乳腺细胞中生产乳汁的方法，克服现有技术的缺陷。
技术实现思路
[0005]本专利技术在一定程度上基于包括乳腺细胞的活细胞构...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种活细胞构建体，包括具上表面和下表面的支架，以及在所述支架的所述上表面之上的(a)活的原代乳腺上皮细胞，(b)由活的原代乳腺上皮细胞、乳腺肌上皮细胞和乳腺祖细胞组成的混合群体，和/或(c)永生化的乳腺上皮细胞的连续单层；(a)活的原代乳腺上皮细胞，(b)由活的原代乳腺上皮细胞、乳腺肌上皮细胞和乳腺祖细胞组成的混合群体，和/或(c)永生化的乳腺上皮细胞的所述连续单层具有顶面和底面(例如这些细胞形成极化且汇合的细胞单层)，其中所述活细胞构建体包括顶隔室和底隔室，所述顶隔室位于(a)活的原代乳腺上皮细胞，(b)由活的原代乳腺上皮细胞、乳腺肌上皮细胞和乳腺祖细胞组成的混合群体，和/或(c)永生化的乳腺上皮细胞的连续单层的顶面之上并与其相邻，所述底隔室位于所述支架的下表面之下并与其相邻。2.根据权利要求1所述的活细胞构建体，其中，由原代乳腺上皮细胞或永生化乳腺上皮细胞产生的乳汁通过细胞的顶面分泌到顶隔室。3.权利要求1或权利要求2所述的活细胞构建体，其中，底隔室包括基本培养基，所述基本培养基与活的原代乳腺上皮细胞，由活的原代乳腺上皮细胞、乳腺肌上皮细胞和乳腺祖细胞组成的混合群体和/或永生化乳腺上皮细胞的底面接触。4.根据权利要求3所述的活细胞构建体，其中基本培养基包括碳源、化学缓冲系统、一种或多种必需氨基酸、一种或多种维生素和/或辅助因子以及一种或多种无机盐。5.根据权利要求3或权利要求4所述的活细胞构建体，其中基本培养基是催乳培养基，还包括催乳素。6.根据权利要求1至5中任一项所述的活细胞构建体，其中支架被制成二维表面(例如，Transwell过滤器)、三维微图案化表面(例如，微结构生物反应器、脱细胞组织)，或能够组装成束的圆柱形结构(例如，中空纤维生物反应器)。7.根据权利要求1至6中任一项所述的活细胞构建体，其中所述支架的上表面包覆一种或多种细胞外基质蛋白。8.根据权利要求6所述的活细胞构建体，其中所述一种或多种细胞外基质蛋白为胶原蛋白、层粘连蛋白、巢蛋白、腱生蛋白和/或纤维连接蛋白。9.根据权利要求1至8中任一项所述的活细胞构建体，其中所述支架包括天然聚合物、生物相容性合成聚合物、合成肽和/或从其任何组合衍生的复合材料。10.根据权利要求9所述的活细胞构建体，其中所述天然聚合物为胶原蛋白、壳聚糖、纤维素、琼脂糖、海藻酸盐、明胶、弹性蛋白、硫酸乙酰肝素、硫酸软骨素、硫酸角蛋白和/或透明质酸。11.根据权利要求9或权利要求10所述的活细胞构建体，其中所述生物相容性合成聚合物可以是聚砜、聚偏氟乙烯、聚乙烯共醋酸乙烯酯、聚乙烯醇、聚丙烯酸钠、丙烯酸酯聚合物和/或聚乙二醇。12.根据权利要求1到9中任一项所述的活细胞构建体，其中所述的支架是多孔的。13.根据权利要求1至12中任一项所述的活细胞构建体，其中所述活的原代乳腺上皮细胞，由活的原代乳腺上皮细胞、乳腺肌上皮细胞和乳腺祖细胞组成的混合群体，和/或永生
化化乳腺上皮细胞来自哺乳动物。14.根据权利要求1至13中任一项所述的活细胞构建体，其中所述哺乳动物是灵长类动物(如黑猩猩、红毛猩猩、大猩猩、猴(例如,旧大陆、新大陆)、狐猴、人类)、狗、猫、兔子、小鼠、老鼠、马、奶牛、山羊、绵羊、牛、猪、鹿、麝、牛科动物、鲸鱼、海豚、河马、大象、犀牛、长颈鹿、斑马、狮子、猎豹、老虎、熊猫、小熊猫和水獭。15.根据权利要求1至13中任一项所述的活细胞构建体，其中所述哺乳动物来自濒危物种。16.一种在培养中生产乳汁的方法，所述方法包括培养权利要求1至15中任一项所述的活细胞构建体，从而在培养中生产乳汁。17.一种制备活细胞构建体用于在培养中生产乳汁的方法，所述方法包括(a)从乳腺组织的乳腺外植体中分离原代乳腺上皮细胞、乳腺肌上皮细胞和/或乳腺祖细胞，来生产分离的乳腺上皮细胞、乳腺肌上皮细胞和/或乳腺祖细胞；(b)培养所述分离的原代乳腺上皮细胞、乳腺肌上皮细胞和/或乳腺祖细胞，来生产乳腺上皮细胞、乳腺肌上皮细胞和/或乳腺祖细胞的混合群体；(c)在支架上培养(b)的混合群体，所述支架具有上表面和下表面，以在所述支架的上表面之上生产所述混合群体的原代乳腺上皮细胞、乳腺肌上皮细胞和/或乳腺祖细胞的极化且连续(即汇合)的单层，其中所述极化且连续的单层包括顶面和底面，从而生产用于在培养中生产乳汁的活细胞构建体。18.根据权利要求17所述的方法，进一步包括在支架上进行培育之前，将(b)的分离的原代乳腺上皮细胞、乳腺肌上皮细胞和/或乳腺祖细胞存储，可选择地，存储在冰箱或液氮中。19.一种制备活细胞构建体用于在培养中生产乳汁的方法，所述方法包括:a)从乳腺组织(例如，胸部组织、乳房组织、乳头组织)的乳腺外植体中分离原代乳腺上皮细胞、乳腺肌上皮细胞和/或乳腺祖细胞，来生产分离的乳腺上皮细胞、乳腺肌上皮细胞和/或乳腺祖细胞；(b)培养所述分离的原代乳腺上皮细胞、乳腺肌上皮细胞和/或乳腺祖细胞，来生产原代乳腺上皮细胞、乳腺肌上皮细胞和乳腺祖细胞的混合群体；(c)对原代乳腺上皮细胞、乳腺肌上皮细胞和/或乳腺祖细胞的所述混合群体进行分类，来生产原代乳腺上皮细胞群体；以及(d)在支架上培育原代乳腺上皮细胞群体，所述支架具有上表面和下表面，以在支架的所述上表面之上生产原代乳腺上皮细胞的极化且连续(即汇合)的单层，其中所述极化且连续的单层包括顶面和底面，从而生产用于在培养中生产乳汁的活细胞构建体。20.一种制备活细胞构建体用于在培养中生产乳汁的方法，所述方法包括(a)培养永生化的乳腺上皮细胞，来生产更多的永生化的乳腺上皮细胞；(b)在支架上培育(a)中的永生化的乳腺上皮细胞，所述支架具有上表面和下表面，以在所述支架的上表面之上生产永生化的乳腺上皮细胞的极化且连续(即汇合)的单层，其中所述极化且连续的单层包括顶面和底面，从而生产用于在培养中生产乳汁的活细胞构建体。21.根据权利要求20所述的方法，其中在培养永生化乳腺上皮细胞之前，所述方法包
括:(i)从乳腺组织(例如，胸部组织、乳房组织、乳头组织)的乳腺外植体中分离原代乳腺上皮细胞、乳腺肌上皮细胞和/或乳腺祖细胞，以生产分离的乳腺上皮细胞、乳腺肌上皮细胞和/或乳腺祖细胞；(ii)培养所述分离的原代乳腺上皮细胞、乳腺肌上皮细胞和/或乳腺祖细胞，来生产由原代乳腺上皮细胞、乳腺肌上皮细胞和乳腺祖细胞组成的混合群体；(iii)将由原代乳腺上皮细胞、乳腺肌上皮细胞和/或乳腺祖细胞组成的所述混合群体进行分类，来生产原代乳腺上皮细胞群体；和(iv)用一个或多个编码人类端粒酶逆转录酶(hTERT)的核酸或猿猴病毒40(SV40)稳定转染(iii)中的原代乳腺上皮细胞群体中的一个或多个细胞；或用小发卡RNA(shRNA)稳定转导(iii)中的原代乳腺上皮细胞群体中的一个或多个细胞至p16细胞周期依赖性激酶抑制剂4(p16(INK4))和细胞周期进入和增殖代谢主要调节因子(c
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MYC)，以生产永生化的乳腺上皮细胞。22.根据权利要求20所述的方法，其中永生化的细胞系可以被一个或多个编码hTERT的核酸或SV40稳定转染；或永生化的细胞系可以被小发卡RNA(shRNA)稳定地转导到p16细胞周期依赖性激酶抑制剂4)(p16(INK4))和细胞周期进入和增殖代谢主要调节因子(c
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MYC)。23.根据权利要求19至22中任一项所述的方法，进一步包括在支架上培育之前,存储原代乳腺上皮细胞群体或永生化乳腺上皮细胞，可选择地，其中在冰箱或液氮中进行存储。24.根据权利要求17至23中任一项所述的方法，其中单层的底面与支架的上表面相邻。25.根据权利要求17至24中任一项所述的方法，其中，活细胞构建体包括与单层的顶面相邻的顶隔室。26.根据权利要求17至25中任一项所述的方法，其中,活细胞构建体包括与支架的下表面相邻的底隔室。27.根据权利要求17至26中任一项所述的方法，其中,培养是在温度约35℃至约39℃，可选择地约37℃下进行。28.根据权利要求17至27中任一项所述的方法，其中，培养是在大气中CO2浓度约4％至约6％的情况下进行的，可选择地约5％。29.根据权利要求17至28中任一项所述的方法，其中(b)中的培养包括在约每天至约每10天进行更换的培养基中进行培养，可选择地约每天至约每3天进行更换。30.根据权利要求19至29中任一项所述的方法，其中分离和分类是通过荧光激活细胞分选、磁激活细胞分选和/或微流控细胞分选进行。31.一种在培养中生产乳汁的方法，包括，培养活细胞构建体，所述活细胞构建体包括(a)支架，所述支架包括上表面、下表面和活的原代乳腺上皮细胞的连续(即汇合)极化单层，由活的原代乳腺上皮细胞、乳腺肌上皮细胞和乳腺祖细胞组成的混合群体的连续极化单层，和/或活的永生化乳腺上皮细胞的连续极化单层；活的原代乳腺上皮细胞的连续(即汇合)极化单层，由活的原代乳腺上皮细胞、乳腺肌上皮细胞和乳腺祖细胞组成的混合群体的所述连续极化单层，和/或活的永生化乳腺上皮细胞的连续极化单层具有顶面和基面，其中活的原代乳腺上皮细胞的连续极化单层，由活的原代乳腺上皮细胞、乳腺肌上皮细
胞和乳腺祖细胞组成的混合群体的连续极化单层，和/或活的永生化乳腺上皮细胞的连续极化单层位于所述支架的上表面之上，(b)底隔室和顶隔室，其中所述支架的所述下表面与底隔室相邻，活的原代乳腺上皮细胞的单层，由活的原代乳腺上皮细胞、乳腺肌上皮细胞和乳腺祖细胞组成的混合群体的单层，和/或活的永生化乳腺上皮细胞的单层的顶面与所述顶隔室相邻，其中，活的原代乳腺上皮细胞的单层，由活的原代乳腺上皮细胞、乳腺肌上皮细胞和乳腺祖细胞组成的混合群体的单层的活的原代乳腺细胞，或永生化乳腺上皮细胞的单层通过其顶面分泌乳汁到所述顶隔室，从而在培养中生产乳汁。32.根据权利要求31所述的方法，其中，所述底...
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