一种外泌体的制备方法技术

本发明专利技术涉及一种外泌体的制备方法，其包括以下步骤：1)采用切向流过滤方法浓缩细胞上清液得到浓缩液；2)采用全能核酸酶对浓缩液进行去核酸处理并经重悬得到粗提液；3)对粗提液进行密度梯度离心，收集外泌体层；4)在离心力小于等于50000g的条件下对外泌体层进行低速离心，去除沉淀得到初步纯化液；5)在离心力大于等于100000g的条件下对初步纯化液进行超速离心，所得沉淀即为外泌体。本发明专利技术方法获得的外泌体，其膜结构完整、不变形，纯度和颗粒浓度更高，相比现有方法制备的外泌体质量更好，同时本发明专利技术方法收率高、成本低，本发明专利技术方法有助于实现外泌体的工业化制备，为以外泌体为载体的靶向药递送研究提供有力的支撑。靶向药递送研究提供有力的支撑。

【技术实现步骤摘要】
一种外泌体的制备方法


[0001]本专利技术涉及一种外泌体的制备方法，具体涉及一种从细胞上清液中分离、纯化外泌体的方法。

技术介绍

[0002]细胞外囊泡(extracellular vehicles，EVs)是由古细菌、细菌和真核生物的大多数细胞分泌的微小膜泡。细胞外囊泡的大小为纳米级别，具有双层封闭膜结构，其包含脂质、RNA、代谢物、生长因子和细胞因子等成分。细胞外囊泡能够调节复杂的细胞通讯，维持生物体的正常生理或引发严重的疾病。根据细胞外囊泡的生物发生和分泌机制，通常将细胞外囊泡分为三种亚型：外泌体、微囊泡和凋亡小体，其中外泌体的生物发生和分泌机制是细胞质膜向内出芽并随后形成多囊泡体，多囊泡体与细胞质膜融合，分泌到胞外，形成粒径在30
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200nm的膜性囊泡。
[0003]随着靶向药物递送领域的发展，纳米药物载体得到越来越多的关注。外泌体作为一种天然来源的递送载体，具有免疫原性低、毒副作用小、对受体细胞有一定的选择性、与核酸分子亲和性高、能够透过血脑屏障等优点，因此众多生物医药公司投入外泌体载药平台的开发中，而获得高质量的外泌体是外泌体载药的先决条件。
[0004]外泌体的提取技术主要包括超速离心法、密度梯度离心法、化学沉淀法、尺寸排阻法、免疫捕获法等。超速离心根据样品中外泌体、蛋白质、细胞碎片、细胞以及细胞器等物质沉降速度的差异，通过不同的离心力和离心时间，将外泌体上清液分离；密度梯度离心法利用外泌体与其他溶质的密度差异而实现分离；化学沉淀法通过聚乙二醇(PEG)等，改变外泌体溶解度和分散性，使溶解性较低的组分从溶液中析出；尺寸排阻法是根据外泌体大小利用色谱柱进行分离提取的方法。虽然已经开发了上述多种外泌体提取技术，但是在实际的制备中，这些方法很难同时兼顾外泌体的质量和收率。保证质量，例如提高纯度和外泌体结构稳定性，则无法提高收率，导致外泌体的生产成本和使用成本高，生产效率低；保证收率，则外泌体的纯度、外泌体膜结构的完整性、外泌体的天然活性等质量下降，例如外泌体提取物中常常无法避免含有细胞残留的蛋白、核酸、或者细胞产生的其它结构的囊泡，对外泌体的功能性发挥带来极大的影响，限制了外泌体载药系统的开发。
[0005]专利CN111321108A公开了一种外泌体分离方法，其采用了PEG6000沉淀，透析和碘克沙醇密度离心共同处理外泌体，虽然缩短了处理时间，但是从其透射电镜结果看来，外泌体的“杯盘”结构不明显，外泌体存在变形，且电镜图中仅含一个外泌体，可知其提高纯度的同时牺牲了收率。
[0006]专利CN1109646694A公开了一种外泌体的提取方法，其基于密度梯度离心和超速离心来提高外泌体的纯度和收率，但是从其透射电镜图看来，外泌体的“杯盘”结构不明显，外泌体存在变形，虽然视野中存在多个外泌体，但是背景嘈杂，说明提取物中杂质较多，其外泌体质量有待提高。
[0007]纵观现有技术，始终缺乏能够同时兼顾外泌体的质量和收率的制备方法。对于外
泌体的载药功能研究来说，如何改进外泌体的制备方法，获得高质量、高收率的外泌体是亟待解决的问题。

技术实现思路

[0008]本专利技术所解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种改进的外泌体的制备方法。
[0009]为解决以上技术问题，本专利技术采用如下技术方案：
[0010]一种外泌体的制备方法，其特征在于：所述制备方法包括以下步骤：
[0011]1)采用切向流过滤方法浓缩细胞上清液得到浓缩液，其中采用截留分子量为100kDa～750kDa的中空纤维柱来进行切向流浓缩，且浓缩倍数为10～20倍；
[0012]2)采用全能核酸酶对所述浓缩液进行去核酸处理并经重悬得到粗提液；
[0013]3)对所述粗提液进行密度梯度离心，收集外泌体层；
[0014]4)在离心力小于等于50000g的条件下对所述外泌体层进行低速离心，去除沉淀得到初步纯化液；
[0015]5)在离心力大于等于100000g的条件下对所述初步纯化液进行超速离心，所得沉淀即为所述外泌体。
[0016]优选地，步骤1)中，所述切向流过滤方法采用截留分子量为100kDa～500kDa的中空纤维柱，进一步地，可选择100kDa或200kDa或300kDa或500kDa的中空纤维柱。
[0017]优选地，步骤1)中，所述浓缩的倍数为10倍、12倍、14倍、16倍、18倍或20倍。
[0018]优选地，步骤2)中，向所述浓缩液中加入全能核酸酶和水溶性金属盐，控制温度25℃～37℃，使浓缩液中的核酸裂解，之后在离心力为100000g～200000g的条件下进行超速离心，收集沉淀并使用缓冲液溶解，得到所述粗提液。
[0019]进一步优选地，步骤2)中使用的水溶性金属盐包括但不限于水溶性镁盐、水溶性钙盐、水溶性锰盐。更进一步优选水溶性金属盐为氯化镁、氯化钙或氯化锰中的一种或多种。
[0020]具体地，采用水浴的方式控制温度。
[0021]具体地，用于溶解沉淀的缓冲液为PBS缓冲液、Tris缓冲液或HEPES缓冲液，优选为PBS缓冲液。
[0022]优选地，步骤3)中，采用碘克沙醇溶液和蔗糖缓冲液的混合液作为梯度介质，先加入到离心管中，将所述粗提液与碘克沙醇溶液预混，加入到梯度介质底部，最后用封存液填满离心管，在离心力为100000g～200000g的条件下进行离心，收集外泌体层。
[0023]根据一些具体实施方式，在向所述离心管中加入所述碘克沙醇溶液和蔗糖缓冲液的混合液之前，加入封存液。
[0024]根据一些具体实施方式，所述碘克沙醇溶液和蔗糖缓冲液的混合液由碘克沙醇溶液与蔗糖缓冲液按照体积比为1∶(4～6)混合而成，其中碘克沙醇溶液的质量浓度为55％～65％，所述蔗糖缓冲液的pH值为7.0～7.5并且包含有蔗糖、三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(Tris HCl)和乙二胺四乙酸(EDTA)，其中蔗糖的浓度为200mM～300mM。
[0025]根据一些具体实施方式，所述预混时，将质量浓度为55％～65％的碘克沙醇溶液与所述粗提液按照体积比为1∶(1～3)进行混合。
[0026]根据一些具体实施方式，所述封存液为PBS缓冲液、Tris缓冲液或HEPES缓冲液或它们的任意组合。
[0027]离心后，外泌体层为迁移至封存液与梯度介质之间的白色界面层。
[0028]本专利技术中，通过优化的前期处理，使得密度梯度离心时所需的层次更少，操作更加方便。
[0029]根据一些具体实施方式，所述蔗糖缓冲液的组分包括200mM～300mM的蔗糖、5mM～15mM的Tris HCl、0.5mM～1.5mM的EDTA。
[0030]优选地，步骤4)中采用的离心力为20000g～50000g。通过采用适当的离心力，既能有效去除外泌体梯度层中残留的蛋白质，又能避免外泌体析出。
[0031]优选地，步骤5)中采用的离心力为100000g～200000g，进一步优本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种外泌体的制备方法，其特征在于：所述制备方法包括以下步骤：1)采用切向流过滤方法浓缩细胞上清液得到浓缩液，其中采用截留分子量为100kDa～750kDa的中空纤维柱来进行切向流浓缩，且浓缩倍数为10～20倍；2)采用全能核酸酶对所述浓缩液进行去核酸处理并经重悬得到粗提液；3)对所述粗提液进行密度梯度离心，收集外泌体层；4)在离心力小于等于50000g的条件下对所述外泌体层进行低速离心，去除沉淀得到初步纯化液；5)在离心力大于等于100000g的条件下对所述初步纯化液进行超速离心，所得沉淀即为所述外泌体。2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤1)中，所述切向流过滤方法采用截留分子量为100kDa或200kDa或300kDa或500kDa的中空纤维柱。3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤2)中，向所述浓缩液中加入全能核酸酶和水溶性镁盐，控制温度25℃～37℃，使浓缩液中的核酸裂解，之后在离心力为100000g～200000g的条件下进行超速离心，收集沉淀并使用缓冲液溶解，得到所述粗提液。4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤3)实施如下：采用碘克沙醇溶液和蔗糖缓冲液的混合液作为梯度介质，先加入到离心管中；将所述粗提液与碘克沙醇溶液预混，加入到梯度介质底部，最后用封存液填满离心管；在离心力为100000g～200000g的条件下进行离心，收集外泌体层。5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：在向所述离心管中加入所述碘克沙醇溶液和蔗糖缓冲液的混合液之前，加入封存液；所述碘克沙醇溶液和蔗糖缓冲液的混合液由碘克沙醇溶液与蔗糖缓冲液按照体积比为1：(4～6)混合而成，其中碘克沙醇溶液的质量浓度为55％～65％，所述蔗糖缓冲液的pH值为7.0～7.5并且包含有蔗糖、三羟甲基氨基甲烷盐酸盐和乙二胺四乙酸，其中蔗糖的浓度为200mM～300mM；所述预混时，将质量浓度为55％～65％的碘克沙醇溶液与所述粗提液按照体积比为1∶(1～3)进行混合；所述封存液为PBS缓冲液、Tris缓冲液或HEPES缓冲液或它们的任意组合。6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤4)中采用的离心力为20000g～50000g；和/或，步骤5)中采用的离心力为100000g～200000g。7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述制备方法具体如下：(1)采用截留分子量为100kDa～750kDa的切向流过滤方法将细胞上清液浓缩10～20倍，得到浓缩液；(2...

【专利技术属性】
技术研发人员：翟艳华，杨诗逸，王晓煜，何新军，许可，
申请(专利权)人：苏州唯思尔康科技有限公司，
类型：发明
国别省市：