肠上皮细胞的制造方法及其利用技术

本发明专利技术的课题在于提供一种通过对多能干细胞进行分化诱导而制造每单位面积的细胞数多且针对咪达唑仑等CYP3A4底物药剂的动态预测精度高的肠上皮细胞的方法以及上述肠上皮细胞、细胞片、被验物质的评价方法、被验物质的筛选试剂盒及细胞制剂。根据本发明专利技术，提供肠上皮细胞的制造方法，其包括：第一分化工序，使多能干细胞分化为肠干细胞；增殖工序，使分化工序中所得到的肠干细胞增殖；及第二分化工序，使增殖工序中所得到的肠干细胞分化为肠上皮细胞，其中，增殖工序为使肠干细胞成为特定的状态的工序。状态的工序。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】肠上皮细胞的制造方法及其利用


[0001]本专利技术涉及一种包括对多能干细胞进行分化诱导的肠上皮细胞的制造方法。本专利技术还涉及肠上皮细胞、细胞片、被验物质的评价方法、被验物质的筛选试剂盒及细胞制剂。

技术介绍

[0002]小肠中存在许多药物代谢酶或药物转运体，因此与肝脏同样地，作为与药物的首过效应有关的器官非常重要。因此，在药代动力特性优异的医药品的开发中需要从医药品开发早期阶段开始评价小肠中医药品的膜渗透性或代谢。目前，作为小肠的模型系统，常用源自人结肠癌的Caco
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2细胞。但是，Caco
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2细胞中的药物转运体的表达模式与人的小肠不同。并且，Caco
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2细胞几乎观察不到药物代谢酶的表达及酶诱导，因此难以准确地评价在小肠中的药代动力。因此，为了综合评价小肠中的药物代谢及膜渗透性，期望利用原代小肠上皮细胞，但关于功能方面或供给存在问题，因此难以像原代肝细胞那样被广泛地用作药代动力试验系统。
[0003]人的人工多能干(induced pluripotent stem：iPS)细胞于2007年由山中等人建立。该人iPS细胞为与1998年由Thomson等人建立的人胚胎干(embryonic stem：ES)细胞相同的、具有多分化能力和几乎无限的增殖能力的细胞。与人ES细胞相比，人iPS细胞的伦理问题少，期待作为用于开发医药品的稳定的细胞供给源。
[0004]在专利文献1中，作为能够在维持肠干细胞的性质的状态下维持并培养源自人工多能干细胞的肠干细胞的培养方法，记载有如下内容：在GSK
‑
3β抑制剂、组蛋白去乙酰化抑制剂及血清替代物的存在下或在GSK
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3β抑制剂及血清替代物的存在下培养源自人工多能干细胞的肠干细胞样细胞。
[0005]在专利文献2中，记载有将多能干细胞分化诱导为肠上皮细胞的方法，其包括：(1)使多能干细胞分化为肠干细胞样细胞的工序；及(2)同时使用MEK1抑制剂、DNA甲基化抑制剂、TGFβ受体抑制剂、EGF及cAMP激活物质，使工序(1)中所得到的肠干细胞样细胞分化为肠上皮细胞样细胞的工序。
[0006]现有技术文献
[0007]专利文献
[0008]专利文献1：WO2018/151307号公报
[0009]专利文献2：WO2019/156200号公报

技术实现思路

[0010]专利技术要解决的技术课题
[0011]通过专利文献2中所记载的方法分化诱导的肠上皮细胞具有与人原代小肠细胞(源自活体的肠上皮细胞)相同程度的药物代谢活性酶(CYP3A4)活性。其一方面，要求开发进一步增大每单位面积的细胞数且能够进一步改善针对咪达唑仑等CYP3A4底物药剂的动态预测精度的肠上皮细胞的制造方法。
[0012]本专利技术要解决的课题在于提供通过对多能干细胞进行分化诱导而制造每单位面积的细胞数多且针对咪达唑仑等CYP3A4底物药剂的动态预测精度高的肠上皮细胞的方法。本专利技术要解决的课题还在于提供每单位面积的细胞数多且针对咪达唑仑等CYP3A4底物药剂的动态预测精度高的肠上皮细胞及包含上述肠上皮细胞的细胞片。本专利技术要解决的课题还在于提供使用上述肠上皮细胞或细胞片的被验物质的评价方法、被验物质的筛选试剂盒及细胞制剂。
[0013]用于解决技术课题的手段
[0014]本专利技术人等为了解决上述课题而进行了深入研究。其结果，发现了如下：在包括使多能干细胞分化为肠干细胞的第一分化工序、使分化工序中所得到的肠干细胞增殖的增殖工序及使增殖工序中所得到的肠干细胞分化为肠上皮细胞的第二分化工序的肠上皮细胞的制造方法中的增殖工序中，通过在使肠干细胞成为特定的状态之后分化为肠上皮细胞，能够改善分化后的肠上皮细胞的形态及细胞数，并改善针对咪达唑仑的动态预测精度。本专利技术是根据上述见解而完成的。
[0015]即，根据本专利技术，提供以下专利技术。
[0016]＜1＞一种肠上皮细胞的制造方法，其包括：
[0017]第一分化工序，使多能干细胞分化为肠干细胞；
[0018]增殖工序，使分化工序中所得到的肠干细胞增殖；及
[0019]第二分化工序，使增殖工序中所得到的肠干细胞分化为肠上皮细胞，其中，
[0020]增殖工序为如下工序中的任一工序：
[0021]使第一分化工序中所得到的肠干细胞的密度成为30
×
104细胞/cm2以上的工序；
[0022]与刚进行第一分化工序之后的密度相比，使第一分化工序中所得到的肠干细胞的密度成为2.0倍以上的工序；
[0023]使第一分化工序中所得到的肠干细胞的EdU阳性的比例成为90％以上的工序；或
[0024]与刚进行第一分化工序之后的比例相比，使第一分化工序中所得到的肠干细胞的EdU阳性的比例成为2.0倍以上的工序。
[0025]＜2＞根据＜1＞所述的肠上皮细胞的制造方法，其中，
[0026]增殖工序包括在Wnt激动剂或GSK
‑
3β抑制剂的存在下培养肠干细胞的工序。
[0027]＜3＞根据＜1＞所述的肠上皮细胞的制造方法，其中，
[0028]增殖工序包括在GSK
‑
3β抑制剂及血清替代物的存在下培养肠干细胞的工序。
[0029]＜4＞根据＜1＞至＜3＞中任一项所述的肠上皮细胞的制造方法，其中，
[0030]第一分化工序的结束时的细胞密度为5.0
×
104细胞/cm2～20
×
104细胞/cm2。
[0031]＜5＞根据＜1＞至＜4＞中任一项所述的肠上皮细胞的制造方法，其中，
[0032]在增殖工序中，将第一分化工序中所得到的肠干细胞以成为1.1～3.3倍的细胞密度的方式接种于容器中之后，培养肠干细胞使其增殖。
[0033]＜6＞根据＜1＞至＜5＞中任一项所述的肠上皮细胞的制造方法，其中，
[0034]进行1～10天增殖工序。
[0035]＜7＞根据＜1＞至＜6＞中任一项所述的肠上皮细胞的制造方法，其中，
[0036]在被3容量％～100容量％的细胞外基质涂覆的培养容器上进行增殖工序及第二分化工序。
[0037]＜8＞根据＜1＞至＜6＞中任一项所述的肠上皮细胞的制造方法，其中，
[0038]在添加有1％～10％的细胞外基质的培养基中进行增殖工序及第二分化工序。
[0039]＜9＞根据＜8＞所述的肠上皮细胞的制造方法，其中，
[0040]在仅于细胞培养插件(cell culture insert)的基底外(basolateral)侧添加有1％～10％的细胞外基质的培养基中进行增殖工序及第二分化工序。
[0041]＜10＞根据＜1＞至＜9＞中任一项所述的肠上皮细胞的制造方法，其中，
[0042]第二分化工序包括在MEK1抑制剂、DNA甲基化抑制剂、TGFβ受体抑制剂、EGF及c本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种肠上皮细胞的制造方法，其包括：第一分化工序，使多能干细胞分化为肠干细胞；增殖工序，使分化工序中所得到的肠干细胞增殖；及第二分化工序，使增殖工序中所得到的肠干细胞分化为肠上皮细胞，其中，增殖工序为如下工序中的任一工序：使第一分化工序中所得到的肠干细胞的密度成为30
×
104细胞/cm2以上的工序；与刚进行第一分化工序之后的密度相比，使第一分化工序中所得到的肠干细胞的密度成为2.0倍以上的工序；使第一分化工序中所得到的肠干细胞的EdU阳性的比例成为90％以上的工序；或与刚进行第一分化工序之后的比例相比，使第一分化工序中所得到的肠干细胞的EdU阳性的比例成为3倍以上的工序。2.根据权利要求1所述的肠上皮细胞的制造方法，其中，增殖工序包括在Wnt激动剂或GSK
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3β抑制剂的存在下培养肠干细胞的工序。3.根据权利要求1所述的肠上皮细胞的制造方法，其中，增殖工序包括在GSK
‑
3β抑制剂及血清替代物的存在下培养肠干细胞的工序。4.根据权利要求1至3中任一项所述的肠上皮细胞的制造方法，其中，第一分化工序结束时的细胞密度为5.0
×
104细胞/cm2～20
×
104细胞/cm2。5.根据权利要求1至4中任一项所述的肠上皮细胞的制造方法，其中，在增殖工序中，将第一分化工序中所得到的肠干细胞以成为1.1～3.3倍的细胞密度的方式接种在容器中之后，培养肠干细胞使其增殖。6.根据权利要求1至5中任一项所述的肠上皮细胞的制造方法，其中，进行1～10天增殖工序。7.根据权利要求1至6中任一项所述的肠上皮细胞的制造方法，其中，在被3容量％～100容量％的细胞外基质涂覆的培养容器上进行增殖工序及第二分化工序。8.根据权利要求1至6中任一项所述的肠上皮细胞的制造方法，其中，在添加有1％～10％的细胞外基质的培养基中进行增殖工序及第二分化工序。9.根据权利要求8所述的肠上皮细胞的制造方法，其中...

【专利技术属性】
技术研发人员：今仓悠贵，美马伸治，小椋泉，山崎奈穗，
申请(专利权)人：富士胶片株式会社，
类型：发明
国别省市：