HEK293单克隆细胞群的培养方法技术

本发明专利技术涉及一种HEK293单克隆细胞群的培养方法。本发明专利技术通过采用第一培养基和第二培养基对HEK293细胞进行培养，仅需4

【技术实现步骤摘要】
HEK293单克隆细胞群的培养方法


[0001]本专利技术涉及单克隆细胞筛选和培养领域，具体涉及HEK293单克隆细胞群的培养方法。

技术介绍

[0002]复杂的生物药物生产基本上都是依赖于哺乳动物细胞系，其中CHO细胞系因为其技术发展较早相对成熟，成为主流细胞系。CHO细胞表达蛋白转录后修饰与人源蛋白存在明显差别，尤其在糖型修饰方面，对药效存在不利影响。因此并不是所有的重组蛋白都适合用CHO细胞表达(Swiech,Picanco
‑
Castro et al.2012)。人源细胞系表达人源性重组蛋白，其翻译后修饰更接近天然的人源蛋白，所以人源细胞系越来越受到人们的关注。在人源细胞系中，HEK293(The human embryonic kidney cell line)因其转染效率高、生长速度快以及可实现高密度悬浮无血清培养而被广泛关注。自2015年以来FDA批准了7种HEK细胞衍生产品(Tan,Chin et al.2021)。
[0003]自1973年以来，通过研究者的不懈努力，目前已经衍生出的HEK393细胞系有11种之多，并且已经能购买到适应无血清悬浮培养的商业化HEK293细胞。不同于CHO细胞系，目前市售商业化HEK293细胞系以瞬时表达为主。近年来对HEK293细胞系的研究不断深入，GS筛选系统和DHFR筛选系统(李景传,薛博夫,袁媛,等,2015)均有报道用于HEK293细胞稳定表达细胞株的筛选(Abaandou,Quan et al.2021)。但与CHO细胞相比，HEK293细胞在重组蛋白表达方面起步较晚，相关技术并不成熟。
[0004]在单克隆细胞筛选方面，CHO细胞单克隆细胞株筛选技术相对成熟，市售多款针对悬浮单克隆筛选培养基。HEK293细胞相关技术发展较晚，HEK293细胞多采用贴壁细胞进行稳定转染及单克隆筛选，后经过悬浮驯化，用于蛋白稳定表达。此方法涉及到细胞消化及单克隆驯化，步骤繁琐且耗费时间，不利用HEK293细胞的商业化应用。目前没有针对HEK293悬浮单克隆细胞群的培养方法。

技术实现思路

[0005]本专利技术提供了一种针对HEK293悬浮细胞的单克隆细胞群的培养方法，旨在解决现有的HEK293单克隆细胞群的筛选和培养存在耗时长、成本高的问题。
[0006]相应地，本专利技术提供了一种HEK293单克隆细胞群的培养方法，其包括如下步骤：
[0007](1)利用有限稀释法，将HEK293细胞进行单克隆铺板，以第一培养基进行培养；
[0008](2)选取阳性克隆孔；
[0009](3)以第二培养基对所述阳性克隆孔中的细胞进行扩增培养，得到HEK293单克隆细胞群；
[0010]其中，所述第一培养基为添加有FBS(胎牛血清)的DMEM培养基和/或MEM培养基；
[0011]所述第二培养基包含FreeStyle293培养基(FreeStyle293表达培养基(FreeStyle293Expression medium)，本文简称“FreeStyle293培养基”)。
[0012]本专利技术的专利技术人发现，以DMEM培养基和/或MEM培养基培养HEK293细胞时，细胞贴壁紧密且细胞间边界不清晰，细胞传代培养时需要用到PBS冲洗、胰酶消化等实验步骤；如以FreeStyle293培养基培养HEK293细胞时，又存在细胞成克隆率太低，难以满足单克隆细胞的高通量筛选的问题。对此，专利技术人经深入研究，得到了适用于培养HEK293单克隆细胞群的培养基组合。具体地，本专利技术先使用DMEM培养基和/或MEM培养基对HEK293单细胞进行贴壁培养，以满足单克隆生长，实现单克隆细胞的早期分裂并提高成克隆率；然后采用包含FreeStyle293培养基的第二培养基进行扩增培养，使细胞处于容易重悬的状态，可在不经胰酶消化的情况下直接吹起重悬，省去了胰酶消化和额外的悬浮驯化步骤，确保传代培养细胞的生长状态，最终获得细胞状态均一、活率高的HEK293单克隆细胞群。
[0013]在一些实施方案中，所述第一培养基为DMEM培养基，以提高HEK293细胞的成克隆率。优选地，所述第一培养基中所述FBS的含量为5％
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20％，更优选15％。随着血清含量的增加，细胞生长更快。
[0014]在一些实施方案中，所述第二培养基还包含DMEM培养基和/或MEM培养基。即，在扩增培养时，既可以将所述第一培养基一次性全部替换为FreeStyle293培养基，也可以逐步替换为FreeStyle293培养基。从方便操作的角度出发，优选在扩增培养时一次性替换为FreeStyle293培养基。从提高细胞成克隆率的角度出发，优选先将所述第一培养基的一部分(例如四分之三)替换为FreeStyle293培养基，然后逐渐增加FreeStyle293培养基的比例，最终仅使用FreeStyle293培养基。在本专利技术一具体实施例中，通过逐步替换为FreeStyle293培养基的方式，细胞成克隆率为50
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70％。
[0015]在一些实施方案中，所述第二培养基中还包含0
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5％的FBS，以使细胞状态好、生长速度快，成克隆率更高。
[0016]在一些实施方案中，以所述第一培养基进行培养的天数为5
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8天，例如5天、6天、7天或8天，优选7天。培养天数太短，会影响最终的成克隆率；培养天数太长，会影响细胞转到24孔板后的生长状态。
[0017]在一些实施方案中，以所述第二培养基进行扩增培养的天数为13天以上。此时，HEK293单克隆细胞群已经形成一定规模，存活率高。优选地，所述扩增培养的天数为18
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25天，例如18天、19天、20天、21天、22天、23天、24天或25天。
[0018]在一些实施方案中，所述单克隆铺板中，所述HEK293细胞为0.5个细胞/孔。采用有限稀释法进行单克隆铺板是本领域已知方法，在本专利技术中，例如对96孔板进行铺板时，可以通过以下方式进行：选定一96孔板，每孔加液量(150μL)，所需总培养基量为：96*0.15＝14.4mL，所需总细胞数为：96*0.5＝48个细胞，即配制14.4mL含48个细胞的培养基，然后进行单克隆铺板。
[0019]在一些实施方案中，所述板为96孔板。可以理解的是，也可以使用其他孔数的培养板，包括但不限于48孔板、384孔板、1536孔板等。
[0020]在一些实施方案中，所述HEK293细胞为HEK293悬浮细胞或HEK293贴壁细胞。在一些实施方案中，所述HEK293细胞为HEK293悬浮细胞。
[0021]在一些实施方案中，可以在扩增培养以使HEK293单克隆细胞扩增为细胞群，而无需进行额外的悬浮驯化步骤，此时所述扩增培养包括：
[0022](i)在96孔板中对所述阳性克隆进行扩增培养，直至细胞汇合率为40％
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100％，优
选90％；
[0023](ii)本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种HEK293单克隆细胞群的培养方法，其特征在于，包括如下步骤：利用有限稀释法，将HEK293细胞进行单克隆铺板，以第一培养基进行培养；选取阳性克隆孔；以第二培养基对所述阳性克隆孔中的细胞进行扩增培养，得到HEK293单克隆细胞群；其中，所述第一培养基为添加有FBS的DMEM培养基和/或MEM培养基；所述第二培养基包含FreeStyle293培养基。2.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于，所述第一培养基中，所述FBS的含量为5％
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20％，优选15％。3.根据权利要求1或2所述的培养方法，其特征在于，所述第二培养基还包含DMEM培养基和/或MEM培养基。4.根据权利要求1
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3任一项所述的培养方法，其特征在于，所述第二培养基中还包含0
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5％的FBS。5.根据权利要求1
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4任一项所述的培养方法，其特征在于，以所述第一培养基进行培养的天数为5
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8天，优选7天；和/或以所述第二培养基进行扩增培养的天数为13天以上，优选18
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25天。6.根据权利要求1
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5任一项所述的培养方法，其特征在于，所述单克隆铺板中，所述板为96孔板。7.根据权利要求1
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6任一项所述的培养方法，其特征在于，所述扩增培养包括：(i)在96孔板中对所述阳性克隆进行扩增培养，直至细胞汇合率为40％

【专利技术属性】
技术研发人员：王帅，王宇婷，魏仙仙，刘忠凯，裴秀芝，卢世香，刁树青，
申请(专利权)人：青岛万明赛伯药业有限公司，
类型：发明
国别省市：