一种同时检测两种真菌毒素的上转换纸基适配体传感器制造技术

本发明专利技术公开了一种同时检测两种真菌毒素的上转换纸基适配体传感器，属于荧光纸基生物传感领域。本发明专利技术方法，是利用所述用于同时检测玉米赤霉烯酮(ZEN)和赭曲霉毒素A(OTA)的双色上转换纸基适配体传感器，待测样品与双色上转换纸基适配体传感器接触后，经激光照射发出荧光，通过智能便携设备(例如手机)采集荧光图片，同时用智能便携设备的颜色识别软件分析其RGB信号，利用RGB信号的值来实现对两种真菌毒素(ZEN和OTA)的同时可视化检测。本发明专利技术方法具有试剂消耗量小、检测成本低、操作简单、灵敏度高、选择性好和效率高等优点，在复杂食品基质的多种真菌毒素同时快速检测中具有巨大应用潜力。潜力。潜力。

【技术实现步骤摘要】
一种同时检测两种真菌毒素的上转换纸基适配体传感器


[0001]本专利技术涉及一种同时检测两种真菌毒素的上转换纸基适配体传感器，尤其是一种同时可视化检测玉米赤霉烯酮和赭曲霉毒素A的双色上转换纸基适配体传感器，属于荧光纸基生物传感领域。

技术介绍

[0002]玉米赤霉烯酮(ZEN)和赭曲霉毒素A(OTA)是两种经常在玉米、小麦等农产品中同时存在的真菌毒素。其中，ZEN可导致动物雌激素水平紊乱，从而损伤生殖系统，而OTA具有较强的致畸、致癌、致突变和免疫抑制等毒害作用。食品安全国家标准GB 2761
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2017中明确规定谷物及其食品中ZEN及OTA的最高残留限量分别为60μg/kg和5μg/kg。有研究表明，受ZEN和OTA同时污染的谷物可对人类和动物产生协同和加合的毒理学效应，从而导致更高的安全风险。因此，开发一种可同时检测食品中ZEN和OTA的方法具有重要的实践意义。
[0003]目前，传统的方法比如高效液相色谱(HPLC)和液相色谱
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串联质谱(LC
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MS)已被用于真菌毒素的多重检测。尽管它们具有较高的灵敏度和准确性，但，相对耗时，依赖于昂贵的仪器设备和熟练的操作，也无法实现现场快速检测。
[0004]近年来，随着生物识别分子及纳米材料的不断发展，基于各种信号的生物传感方法不断被开发用于真菌毒素的多重检测。然而这些方法仍面临操作步骤繁琐、信号获取依赖庞大的设备等问题。例如，CN 108927079 A披露了真菌毒素通量检测用上转换磁性编码微球及其制备方法，其使用昂贵的抗体作为识别分子，且试剂和样品消耗量大、反应过程多、操作步骤繁琐、检测时间较长，需要使用价格昂贵、大型的荧光显微镜获取信号。
[0005]纸基传感器作为一种受欢迎的现场即时诊断工具，具有样品消耗量少、制作成本低和操作方便等特点，已经与各种信号结合并成功应用于生化分析、医学诊断、环境监测和食品安全分析等领域。Jiang等人结合基于纳米金的比色竞争免疫分析开发了一种纸基分析装置，用于检测食品和饲料中的脱氧雪腐镰刀菌烯醇。其中，荧光纸基传感器是以荧光为输出信号的纸基分析技术。
[0006]但目前，尚未有基于荧光纸基传感器用于同时检测多个真菌毒素的报道，特别是基于多色上转换纳米材料为荧光标记。Ye等人利用量子点包覆的介孔二氧化硅纳米颗粒(QDs/MSN)和氧化石墨烯开发了一种荧光纸基设备用于同时检测三种癌细胞。但，所用量子点为单色量子点，利用荧光分光光度计进行定量，无法实现现场快速检测。与荧光染料和量子点等相比，上转换纳米材料具有光稳定性好、抗光漂白及无自发荧光干扰等优点，在复杂食品基质中具有应用优势，可提高检测灵敏度。CN 105675563 A披露了一种快速定量检测可卡因的上转换荧光纸基分析设备，但该方法使用单色上转换、需要分别将上转换纳米材料和适配体共价连接固定在滤纸上，且上样和检测均在一个区域，无法实现对多个靶标的同时检测。

技术实现思路

[0007]本专利技术提供用于同时检测玉米赤霉烯酮(ZEN)和赭曲霉毒素A(OTA)的双色上转换纸基适配体传感器，以双色上转换纳米粒子为荧光标记，以Cu
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TCPP纳米片为淬灭剂，包括以下组成部分：检测区1、检测区2、样品区，所述检测区1有Apt1
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GUCNPs/Cu
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TCPP纳米片复合物探针，用于响应ZEN浓度变化；所述检测区2有Apt2
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BUCNPs/Cu
‑
TCPP纳米片复合物探针，用于响应OTA浓度变化；所述样品区用于滴加待测样品；所述用于同时检测玉米赤霉烯酮(ZEN)和赭曲霉毒素A(OTA)的双色上转换纸基适配体传感器的制备方法，包括以下步骤：
[0008](1)制备适配体修饰双色上转换纳米粒子Apt1
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GUCNPs和Apt2
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BUCNPs：
[0009]①
制备双色上转换纳米粒子核心NaYF4:Yb,Er和NaYF4:Yb,Tm，并包覆外壳以得到核壳型双色上转换纳米粒子GUCNPs和BUCNPs；
[0010]具体的，
[0011]称取YCl3·
6H2O、YbCl3·
6H2O和ErCl3·
6H2O或TmCl3·
6H2O，然后加入油酸(OA)和十八烯(1
‑
ODE)，在N2气氛保护下搅拌均匀，加热保温；自然冷却后，逐滴加入含NaOH和NH4F的甲醇混合溶液，逐渐升温反应，反应结束后，待冷却至室温，加入乙醇进行沉淀，再用环己烷
‑
乙醇混合物洗涤沉淀3次，然后将沉淀重分散于环己烷；
[0012]称取YCl3·
6H2O、YbCl3·
6H2O和NdCl3·
6H2O，加入OA和1
‑
ODE，在N2气氛保护下搅拌均匀，加热保温；冷却至室温后，将上述得到的NaYF4:Yb,Er或NaYF4:Yb,Tm环己烷分散液逐滴加入，加热至100℃保持20min，冷却至室温后，逐滴加入含有NaOH和NH4F的甲醇混合溶液，逐渐升温反应，反应结束后，待冷却至室温，加入乙醇进行沉淀，再用环己烷
‑
乙醇混合物洗涤沉淀3次，然后将沉淀重分散于环己烷；
[0013]②
用聚乙烯亚胺修饰GUCNPs和BUCNPs得到PEI
‑
GUCNPs和PEI
‑
BUCNPs
[0014]将
①
中得到的GUCNPs和BUCNPs分别超声分散于DMSO，逐滴加入溶于DMSO的PEI溶液，然后加热，冷却至室温后用超纯水清洗得到PEI
‑
GUCNPs和PEI
‑
BUCNPs；
[0015]③
制备Apt1
‑
GUCNPs和Apt2
‑
BUCNPs
[0016]取Sulfo
‑
SMCC与PEI
‑
GUCNPs或PEI
‑
BUCNPs混合，避光孵育，清洗并重新分散于HEPES缓冲液，然后加入ZEN适配体(Apt1)或OTA适配体(Apt2)后，混匀过夜孵育，收集并用超纯水清洗后，即可得到Apt1
‑
GUCNPs或Apt2
‑
BUCNPs；
[0017](2)淬灭剂Cu
‑
TCPP纳米片的制备：
[0018]称取Cu(NO3)2·
3H2O和PVP，加入三氟乙酸和DMF
‑
乙醇混合液，搅拌溶解得到混合物1；将TCPP溶解于DMF
‑
乙醇混合液，将其逐滴加入到混合物1中，超声后80℃水浴，离心、收集沉淀并用乙醇清洗；
[0019](3)疏水纸基的制备：
[0020]将打印有图案的滤纸经200℃加热1h以构建疏水载体，自然冷却后，得到疏水纸基本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.制备用于同时检测玉米赤霉烯酮(ZEN)和赭曲霉毒素A(OTA)的双色上转换纸基适配体传感器的方法，其特征在于，所述双色上转换纸基适配体传感器以双色上转换纳米粒子为荧光标记，以Cu
‑
TCPP纳米片为淬灭剂，包括：检测区1、检测区2、样品区，所述检测区1有Apt1
‑
GUCNPs/Cu
‑
TCPP纳米片复合物探针，用于响应ZEN浓度变化；所述检测区2有Apt2
‑
BUCNPs/Cu
‑
TCPP纳米片复合物探针，用于响应OTA浓度变化；所述样品区用于滴加待测样品；所述包括以下步骤：(1)制备适配体修饰双色上转换纳米粒子Apt1
‑
GUCNPs和Apt2
‑
BUCNPs：
①
制备双色上转换纳米粒子核心NaYF4:Yb,Er和NaYF4:Yb,Tm，并包覆外壳以得到核壳型双色上转换纳米粒子GUCNPs和BUCNPs；
②
用聚乙烯亚胺修饰GUCNPs和BUCNPs得到PEI
‑
GUCNPs和PEI
‑
BUCNPs将
①
中得到的GUCNPs和BUCNPs分别超声分散于DMSO，逐滴加入溶于DMSO的PEI溶液，然后加热，冷却至室温后用超纯水清洗得到PEI
‑
GUCNPs和PEI
‑
BUCNPs；
③
制备Apt1
‑
GUCNPs和Apt2
‑
BUCNPs取Sulfo
‑
SMCC与PEI
‑
GUCNPs或PEI
‑
BUCNPs混合，避光孵育，清洗并重新分散于HEPES缓冲液，然后加入巯基修饰的ZEN适配体或OTA适配体，混匀、孵育，收集并用超纯水清洗后，即可得到Apt1
‑
GUCNPs和Apt2
‑
BUCNPs；(2)淬灭剂Cu
‑
TCPP纳米片的制备：称取Cu(NO3)2·
3H2O和PVP，加入三氟乙酸和DMF
‑
乙醇混合液，搅拌溶解得到混合物1；将TCPP溶解于DMF
‑
乙醇混合液，将其逐滴加入到混合物1中，超声后水浴加热保温，离心、收集沉淀并用乙醇清洗；(3)疏水纸基的制备：将打印有图案的滤纸经加热再冷却后，得到疏水纸基；(4)双色上转换纸基适配体传感器的制备：将Apt1
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GUCNPs和Apt2
‑
BUCNPs分别与淬灭剂Cu
‑
TCPP纳米片孵育，从而分别得到Apt1
‑
GUCNPs/Cu
‑
TCPP纳米片复合物探针和Apt2
‑
BUCNPs/Cu
‑
TCPP纳米片复合物探针；往疏水纸基的检测区1和检测区2分别加入Apt1
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GUCNPs/Cu
‑
TCPP纳米片复合物探针和Apt2
‑
BUCNPs/Cu
‑
TCPP纳米片复合物探针，室温自然干燥后即可。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)
①
中所述制备双色上转换纳米粒子核心NaYF4:Yb,Er和NaYF4:Yb,Tm，包括以下步骤：称取YCl3·
6H2O、YbCl3·
6H2O和ErCl3·
6H2O或TmCl3·
6H2O，然后加入油酸(OA)和十八烯(1
‑
ODE)，在N2气氛保护下搅拌均匀，加热保温；自然冷却后，逐滴加入含NaOH和NH4F的甲醇混合溶液，逐渐升温反应，反应结束后，待冷却至室温，加入乙醇进行沉淀，再用环己烷
‑
乙醇混合物洗涤沉淀3次，然后将沉淀重分散于环己烷。3.根据权利要求1或2...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴世嘉，林先锋，段诺，佟鑫玉，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：