光镊操纵细胞形变下检测胞内一氧化氮含量变化的方法技术

本申请公开了光镊操纵细胞形变下检测胞内一氧化氮含量变化的方法。本方案中，上转换纳米探针作为一氧化氮的荧光指示物，通过上转换纳米探针荧光强度的增强反映细胞在机械拉伸过程中一氧化氮含量的变化。通过光镊操控技术，捕获与细胞相连的微球并拉伸细胞发生形变，测定拉伸过程中细胞的形变量以及力谱信息，并通过共聚焦荧光成像技术测定细胞内的上转换纳米探针荧光强度变化，从而反映机械拉伸下细胞内一氧化氮的变化量。本方法可广泛应用于生物物理和生物化学领域，研究机械拉伸下的细胞内生物化学信息的变化和细胞力学信息。细胞内生物化学信息的变化和细胞力学信息。细胞内生物化学信息的变化和细胞力学信息。

【技术实现步骤摘要】
光镊操纵细胞形变下检测胞内一氧化氮含量变化的方法


[0001]本申请涉及细胞形态检测的
，尤其涉及细胞形变过程中胞内一氧化氮含量变化的检测方法。

技术介绍

[0002]细胞形态的改变将引起内部生理结构的变化。甚至，在不同的生理条件下，细胞的分化、生长、粘附以及受到不同外界环境(剪切力、应力等)影响的情况下，细胞的弹性性质都会存在差异。细胞力学性质的变化会对细胞甚至机体的功能产生很大影响甚至产生疾病，比如癌症、血管动脉粥样硬化等。而血管的稳态是由一氧化氮(NO)和活性氧(ROS)调节，而施加在内皮和血管平滑肌上的机械力可以显著影响其产生。
[0003]相关技术中，对细胞内一氧化氮变化在细胞形态变化中的检测，通常是依赖于对群体细胞进行的机械拉伸。这样会对细胞造成较大损伤、时空分辨率不高的问题。

技术实现思路

[0004]有鉴于此，本申请提供光镊操纵细胞形变下检测胞内一氧化氮含量变化的方法，能够减少对细胞损伤，提高成像时空分辨率。
[0005]已为普遍意识到的是，相关技术中，对细胞内一氧化氮变化在细胞形态变化中的检测，通常是依赖于对群体细胞进行的机械拉伸。
[0006]针对现有的研究对于难以对单个正常细胞进行精确的机械拉伸以及存在对细胞较大损伤、时空分辨率不高的问题，本专利技术人发现，将共聚焦荧光成像技术与光镊技术相结合。实现了光镊拉伸上转换纳米探针标记的正常细胞，并对拉伸下细胞内的一氧化氮含量变化进行实时监测，研究细胞形变过程中形变量与力谱信息和荧光强度变化的关系。因此，本专利技术提供了一种将光镊与共聚焦快速荧光成像相结合实现单个细胞的拉伸，并在高时空分辨率下实时检测拉伸细胞的力谱信息和一氧化氮的策略，为检测外界刺激下单细胞形态和生理的改变提供了一种普适性的思路。基于此，创立了本专利技术创造。
[0007]本申请为一种通过光镊拉伸细胞形变下检测胞内一氧化氮含量变化的方法，包括以下步骤：
[0008](1)使上转换纳米颗粒与一氧化氮荧光探针结合，形成上转换纳米探针；
[0009](2)对细胞和手柄微球进行荧光标记；
[0010](3)使所述上转换纳米探针与所述经过荧光标记的细胞结合；
[0011](4)光镊捕获所述经过荧光标记的手柄微球，以使其与细胞接触以对细胞产生拉伸作用；
[0012](5)通过对细胞内的上转换纳米探针进行共聚焦荧光成像，检测在细胞被拉伸的过程中荧光信号的变化，以获得胞内一氧化氮含量变化状况。
[0013]已为所属领域技术人员知晓的是，步骤(4)所涉及的是光镊拉伸技术的原理。具体而言，早在1986年，Ashkin就专利技术了光镊，它利用了一束高度聚焦的高斯激光，与光阱附近
的颗粒产生两种作用力。一种沿着光传播方向运动的力叫做散射力，另一种沿着光场梯度方向，将微粒推向光场梯度最强位置的力叫做梯度力。通过散射力和梯度力的作用将微粒牢牢束缚在光阱中心。相较于其他的宏观细胞拉伸方式，光镊可以在单细胞水平、不同方向上进行机械拉伸。而且光镊采用的是高聚焦激光捕获微球充当手柄去操控细胞形变，不仅实现了细胞保持在正常的生理活性下精确控制微观状态下的拉伸力，还能达到pN/nm的高空间分辨率以及ms级时间分辨率。光镊拉伸单细胞的方式为检测单细胞形态和生理的改变提供了一种普适性的思路。
[0014]已为所属领域技术人员知晓的是，步骤(1)所涉及的上转换纳米探针的具体原理。具体而言，上转换发光在1960年被Bloembergen等人研究，发现稀土离子的4f轨道上丰富的能级能为稀土离子之间能量传递提供可能性，从而提出了一种非线性的连续光学吸收过程，即连续吸收两个或者多个低能量的激发光子，发生跃迁辐射后，产生一个高能量的发射光子。这种发光特性可以使上转换纳米颗粒具有发光半峰宽窄、发光稳定性好、抗光漂能力强等优异的光学性质可以在生物成像的时候几乎不会受到背景发光信号的干扰。合成的上转换纳米颗粒表面修饰的一氧化氮荧光探针(DAF
‑
2DA)能确保在胞内检测极少量的一氧化氮，这种方式下可以将上转换纳米颗粒发射的荧光通过荧光共振能量转移给荧光探针分子进行成像。
[0015]作为一种可示范地实现方式，所述步骤(1)中，使上转换纳米颗粒与一氧化氮荧光探针结合包括：
[0016]在疏水性上转换纳米颗粒的表面修饰二硬脂酰磷脂酰乙醇胺
‑
聚乙二醇
‑
羧基(DSPE
‑
PEG
‑
COOH)，形成羧基修饰的上转换纳米颗粒；
[0017]使所述羧基修饰的上转换纳米颗粒表面与刀豆蛋白A(ConA)结合，形成ConA修饰上转换纳米颗粒；
[0018]使所述ConA修饰上转换纳米颗粒与一氧化氮荧光探针结合，形成上转换纳米探针。
[0019]此处，应当理解的是，上转换纳米颗粒表面修饰的刀豆蛋白A能与细胞膜受体结合。
[0020]作为一种可示范地实现方式，所述一氧化氮荧光探针为5，6
‑
二氨基荧光素二乙酸酯(DAF
‑
2DA)。
[0021]此处，应当理解的是，上转换纳米颗粒表面修饰的DAF
‑
2DA是能够与一氧化氮反应，进行荧光共振能量转移的探针。
[0022]作为一种可示范地实现方式，所述手柄微球包括但不限于聚苯乙烯微球。
[0023]应当能理解的是，手柄微球通常经过蛋白修饰，以能更好地与细胞结合。所述手柄微球为经过蛋白修饰的微球，所述修饰蛋白为刀豆蛋白A、转铁蛋白
‑
生物素等与细胞表面紧密结合的蛋白。
[0024]所述细胞为能够使用光镊进行机械拉伸，杨氏模量较小的所有细胞系。所述细胞为人脐静脉内皮细胞(HUVEC细胞)、狗肾上皮细胞(MDCK细胞)、小鼠单核巨噬细胞白血病细胞(RAW264.7细胞)。
[0025]作为一种可示范地实现方式，所述步骤(3)中，使所述上转换纳米探针与所述经过荧光标记的细胞结合具体为，将上转换纳米探针与经过荧光标记的细胞进行孵育，使上转
换纳米探针通过胞吞进入细胞内部，并将细胞进行消化，使细胞处于半贴壁状态。
[0026]此处，细胞消化至半贴壁状态为细胞贴在共聚焦皿底部，但细胞轮廓为圆形。
[0027]可选地，所述步骤(2)中，荧光标记为通过荧光蛋白或荧光染料进行荧光标记。
[0028]可选地，所述步骤(4)中，在细胞被拉伸过程中同时实施形变大小的测定，其中所述细胞形变大小为初始状态和拉伸细胞后状态的细胞膜形变量。
[0029]可选地，所述步骤(4)中，在细胞被拉伸过程中同时实施力谱信息的测定，其中所述力谱信息为微球受到细胞膜张力作用而偏离光阱中心的相对位置。
[0030]本申请具有以下有益效果：
[0031]1.本申请提供的方法将光镊装置和共聚焦快速荧光成像装置相结合，可以对细胞在受聚苯乙烯微球拉伸的同时实时检测细胞内上转换纳米探针荧光强度的变化，进而反映拉伸本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种光镊操纵细胞形变下检测胞内一氧化氮含量变化的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)使上转换纳米颗粒与一氧化氮荧光探针结合，形成上转换纳米探针；(2)对细胞和手柄微球进行荧光标记；(3)使所述上转换纳米探针与所述经过荧光标记的细胞结合；(4)光镊捕获所述经过荧光标记的手柄微球，以使其与细胞接触以对细胞产生拉伸作用；(5)通过对细胞内的上转换纳米探针进行共聚焦荧光成像，检测在细胞被拉伸的过程中荧光信号的变化，以获得胞内一氧化氮含量变化状况。2.根据权利要求1所述检测方法，其特征在于，所述步骤(1)中，使上转换纳米颗粒与一氧化氮荧光探针结合包括：在疏水性上转换纳米颗粒的表面修饰二硬脂酰磷脂酰乙醇胺
‑
聚乙二醇
‑
羧基(DSPE
‑
PEG
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COOH)，形成羧基修饰的上转换纳米颗粒；使所述羧基修饰的上转换纳米颗粒表面与刀豆蛋白A(ConA)结合，形成ConA修饰上转换纳米颗粒；使所述ConA修饰上转换纳米颗粒与一氧化氮荧光探针结合，形成上转换纳米探针。3.根据权利要求1所述检测方法，其特征在于，所述一氧化氮荧光探针为5，6
‑
二氨基荧光素二乙酸酯(DAF
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【专利技术属性】
技术研发人员：唐宏武，徐大地，方文凯，刘浏，李江涛，
申请(专利权)人：武汉大学，
类型：发明
国别省市：