用于从组织中分离核和细胞的方法技术

从急速冷冻的生物组织中提取且分离固定的生物颗粒例如固定的细胞和/或固定的核的方法产生显著改善量的连接产物，以及靶向单一细胞RNA序列数据质量和后续RNA模板化连接灵敏度的增加。该方法通过减少与常规方法相关的细胞降解和RNA泄漏量，在提取和分离期间保存生物颗粒，例如来自生物组织样品的细胞和/或核的完整性。的完整性。的完整性。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于从组织中分离核和细胞的方法
[0001]相关申请的交叉引用
[0002]本申请要求于2020年2月28日提交的美国临时申请号62/983,278的优先权利益，所述美国临时申请的内容以引用的方式并入本文。


[0003]本专利技术涉及用于从生物组织中分离固定的生物颗粒，包括固定的细胞和/或核的方法，其中所述生物颗粒，包括细胞和/或核，能够成功地用于某些单一生物颗粒(例如，单一细胞或单一核)基因组学、表观基因组学、转录组学和蛋白质组学测定中。

技术介绍

[0004]从组织中回收细胞和或核是活跃的研究领域，其中所述细胞可以支持各种生物反应或生物化学反应。在一些例子中，现有方法可以从组织中解离细胞并随后使解离的细胞固定。然而，所得到的细胞和/或核在用于基因组、表观基因组、转录组和蛋白质组分析的单一细胞测定中可能并不产生良好的结果。例如通过在解离/固定步骤之前在例如液氮中使用生物组织的快速(“闪速”或“急速”)冷冻，改善常规细胞回收方法的尝试，并未产生令人满意的结果。
[0005]用于从组织产生单一细胞和/或核的方法将有利于单一细胞分析领域的研究、开发和诊断，其中细胞/组织、其基因组、分析物等等可以维持一段时间，然后可以用于单一细胞工作流中，以产生成功的结果(例如，与用新鲜细胞获得的结果相当)。

技术实现思路

[0006]此处公开的是用于从组织中获得单一生物颗粒(例如，单一细胞和/或单一核)的方法，其中单一生物颗粒(例如，细胞/核)能够支持某些生物反应/生物化学反应。一般地，使用该方法从组织中获得的生物颗粒，包括细胞和/或核是固定的。一般地，所公开的方法可能不包括用于逆转固定过程的特定步骤(例如，使用解交联剂、解除固定剂或可逆固定试剂)。如通过某些单一细胞基因组、表观基因组、转录组和/或蛋白质组测定的结果所评价的，实现了从所公开的过程获得高质量生物颗粒，例如细胞/核。在一些例子中，所公开的方法产生具有能够支持某些酶促反应的分析物(例如，mRNA、蛋白质)和/或基因组的固定的单一生物颗粒(例如，单一细胞和/或单一核)。测定可以是单一生物颗粒(例如，单一细胞或单一核)测定，包括基于分隔的测定、流式细胞术测定等等。在一些例子中，回收的单一生物颗粒(例如，单一细胞/核)可能具有目的核酸分子(例如，mRNA分子)，其可以用于核酸反应，包括使用核酸探针的模板化核酸连接反应中。在一个实施例中，模板化核酸连接是RNA模板化连接反应(即，连接两个DNA探针同时与RNA模板杂交)。在一些例子中，回收的单一生物颗粒(例如，单一细胞/核)可能具有蛋白质或其它抗原，其可以通过各种方法包括用抗体的特异性染色进行染色。
[0007]在一些例子中，公开的是用于组织样品的核酸分析的方法，其包括(a)使组织样品
与固定试剂接触；(b)在固定试剂的存在下，将组织样品分成组织区段，以允许固定试剂灌注到组织区段内；(c)使组织区段解离，以提供多个生物颗粒，其中所述生物颗粒包含多个样品核酸分子；并且(d)使用所述多个样品核酸分子和多个核酸条形码分子生成多个加条形码的核酸分子。在一些例子中，在步骤(d)之前，该方法还包括使多个核酸探针与多个生物颗粒的多个样品核酸分子杂交。
[0008]在一些例子中，公开的是从生物组织中提取且分离固定的细胞和/或核的方法，其包括获得固定的组织样品；并且使固定的组织样品解离，以获得细胞和/或核。在一些例子中，该方法还包括形成细胞和/或核的悬浮液并过滤悬浮液。在一些例子中，该方法还包括使用细胞和/或核执行单一细胞测定。
[0009]在一些例子中，公开的是在生物组织样品中的核糖核酸(RNA)分析的方法，其包括使生物组织样品与有机固定试剂接触；在有机固定试剂的存在下，将生物组织样品分成组织区段，以允许有机固定试剂灌注到组织区段内；使组织区段解离，以提供多个单一细胞和/或单一核；并且对多个单一细胞和/或单一核执行RNA分析。
[0010]还公开的是通过本文公开的任何方法获得的细胞和/或核的组合物。
[0011]以引用的方式并入
[0012]本说明书中提到的所有出版物、专利和专利申请都以引用的方式并入本文，其程度与每个个别出版物、专利或专利申请特异性地且个别地指示以引用的方式并入相同。在以引用方式并入的出版物和专利或专利申请与说明书中包含的公开内容相矛盾的范围内，说明书预期取代和/或优先于任何此类矛盾的材料。
[0013]下述美国专利和美国公开专利申请各自以引用的方式整体并入本申请内：
[0014]于2017年5月9日颁发，且名称为“Partitioning And Processing Of Analytes And Other Species”的美国专利号9,644,204(序列号14/175,935)；
[0015]于2018年5月22日颁发，且名称为“Instrument Systems For Integrated Sample Processing”的美国专利号9,975,122(序列号14/934,044)；
[0016]于2018年8月21日颁发，且名称为“Capsule Array Devices And Methods Of Use”的美国专利号10,053,723(序列号15/719,459)；和
[0017]于2018年9月11日颁发，且名称为“Fluidic Devices,Systems,And Methods For Encapsulating And Partitioning Reagents,And Applications Of Same”的美国专利号10,071,377(序列号15/687,856)。
[0018]以引用的方式并入的其它参考文献可以在申请各处列出。
附图说明
[0019]在并入说明书中且构成说明书的部分的附图中，示出了本专利技术的实施例。应了解，附图中所示的实施例显示用于说明的目的而不是用于限制。应了解，可以制备附图中所示的实施例的改变、修改和偏离，而不背离如下文公开的本专利技术的精神和范围。
[0020]图1是用于从组织产生单个固定细胞的示例方法中的步骤的示意图。
[0021]图2显示了用于分隔个别生物颗粒的微流体通道结构的例子。
[0022]图3显示了用于将携加条形码的珠递送至液滴的微流体通道结构的例子。
[0023]图4显示了用于共分隔生物颗粒和试剂的微流体通道结构的例子。
[0024]图5显示了用于将珠受控分隔到离散液滴内的微流体通道结构的例子。
[0025]图6显示了用于增加液滴生成流通量的微流体通道结构的例子。
[0026]图7显示了用于增加液滴生成流通量的微流体通道结构的另一个例子。
[0027]图8是在使用RNA模板化连接方案的进一步加工之后，关于根据本专利技术产生的固定的解离的组织细胞和细胞核的图像强度相对于碱基对大小的生物分析仪图。
[0028]图9是单独的3000细胞装载电泳图的复制品，其中对于本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种用于组织样品的核酸分析的方法，其包括：a)使组织样品与固定试剂接触；b)在固定试剂的存在下，将组织样品分成组织区段，以允许固定试剂灌注到组织区段内；c)使组织区段解离，以提供多个生物颗粒，其中所述生物颗粒包含多个样品核酸分子；以及d)使用所述多个样品核酸分子和多个核酸条形码分子生成多个加条形码的核酸分子。2.根据权利要求1所述的方法，其中在步骤d)之前，所述方法还包括使多个核酸探针与所述多个生物颗粒的多个样品核酸分子杂交。3.根据权利要求2所述的方法，其中第一探针和第二探针与生物颗粒的样品核酸分子杂交，以形成包含第一探针、第二探针和样品核酸分子的核酸复合物。4.根据权利要求3所述的方法，其中所述核酸复合物包含条形码序列。5.根据权利要求4所述的方法，其中所述第一探针或所述第二探针包含条形码序列。6.根据权利要求4所述的方法，其中生成步骤d)包括将所述多个生物颗粒分隔到多个分隔内。7.根据权利要求6所述的方法，其中所述多个分隔是多个液滴或多个孔。8.根据权利要求1所述的方法，其中所述组织样品是固体组织样品。9.根据权利要求1所述的方法，其中所述组织样品是新鲜的组织样品。10.根据权利要求1所述的方法，其中所述组织样品是冷冻的组织样品。11.根据权利要求10所述的方法，其中所述冷冻的组织样品是急速冷冻或闪速冷冻的组织样品。12.根据权利要求1所述的方法，其中所述多个生物颗粒包含多个单一细胞。13.根据权利要求1所述的方法，其中所述多个生物颗粒包含多个单一核。14.根据权利要求1所述的方法，其中所述多个生物颗粒包含多个单一细胞和多个单一核。15.根据权利要求1所述的方法，其中所述多个样品核酸分子包括核糖核酸(RNA)分子。16.根据权利要求15所述的方法，其中所述RNA分子包含信使RNA分子。17.根据权利要求3所述的方法，其中所述生物颗粒包含所述核酸复合物。18.根据权利要求17所述的方法，其中所述生物颗粒还包含标记试剂。19.根据权利要求18所述的方法，其中所述标记试剂配置为与所述生物颗粒的特征联接。20.根据权利要求19所述的方法，其中所述特征选自受体、抗原、表面蛋白质、跨膜蛋白质、分化蛋白簇、蛋白质通道、蛋白质泵、载体蛋白质、磷脂、糖蛋白、糖脂、细胞
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细胞相互作用蛋白质复合物、抗原呈递复合物、主要组织相容性复合物、工程化的T细胞受体、T细胞受体、B细胞受体、嵌合抗原受体、间隙连接和粘着连接。21.根据权利要求18所述的方法，其中所述标记试剂选自蛋白质、肽、抗体、亲脂性部分、细胞表面受体结合分子、受体配体、小分子、双特异性抗体、双特异性T细胞衔接子、T细胞受体衔接子、B细胞受体衔接子、前抗体、适体、单体、affimer、Darpin和蛋白质支架。22.根据权利要求19所述的方法，其中所述标记试剂包含报道寡核苷酸。
23.根据权利要求22所述的方法，其中所述报道寡核苷酸包含报道序列。24.根据权利要求23所述的方法，其中所述报道序列鉴定所述特征。25.根据权利要求1所述的方法，其中所述固定试剂是有机固定试剂。26.根据权利要求25所述的方法，其中所述有机固定试剂选自醇、酮、醛、交联剂、辛二酸二琥珀酰亚胺酯(DSS)、辛二亚氨酸二甲基酯(DMS)、福尔马林、己二亚氨酸二甲基酯(DMA)、二硫代
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双(
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丙酸琥珀酰亚胺酯)(DSP)、酒石酸二琥珀酰亚胺酯(DST)、乙二醇双(...

【专利技术属性】
技术研发人员：贾瓦德，
申请(专利权)人：一零X基因组学有限公司，
类型：发明
国别省市：