一种应用HPLC-ELSD检测发酵液中前体缬氨酸的方法技术

本发明专利技术公开了一种HPLC

【技术实现步骤摘要】
一种应用HPLC
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ELSD检测发酵液中前体缬氨酸的方法


[0001]本专利技术涉及缬氨酸检测领域，具体为一种应用HPLC
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ELSD检测发酵液中前体缬氨酸的方法。

技术介绍

[0002]缬氨酸是组成蛋白质的20种氨基酸的一种，含有五个碳原子的支链非极性α
‑
氨基酸，通常为白色单斜晶系晶体或结晶性粉末，无臭，有特殊苦味，对热、光及空气稳定，易溶于水。缬氨酸可以被微生物直接吸收，提高蛋白质的合成速度，在微生物发酵领域具有广泛的应用。在发酵过程中，适量添加缬氨酸能够促进目标产物合成，因此实时监测、控制缬氨酸浓度具有重要意义。
[0003]目前，常规检测缬氨酸的方法依靠紫外检测器进行检测。由于缬氨酸本身没有紫外吸收，使用该方法时，需要先对缬氨酸进行衍生再测定，操作繁琐，费时费力，难以实现实时监测。此外，发酵样品中存在多种杂质，而缬氨酸含量低，因此亟需专利技术一种高效、精准的检测方法。ELSD是一种通用型检测器，检测过程不依赖样品的光学特性，也不受其官能团的影响，任何挥发性低于流动相的样品均能被检测，因而可以尝试通过HPLC
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ELSD快速检测发酵样品中的前体缬氨酸。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的在于提供一种应用HPLC
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ELSD检测发酵液中前体缬氨酸的方法，以解决上述
技术介绍
中提出的问题。
[0005]为了解决上述技术问题，本专利技术提供如下技术方案：一种应用HPLC
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>ELSD检测发酵液中前体缬氨酸的方法。检测方法包括以下步骤：a、制备缬氨酸对照品溶液和发酵液样品溶液；b、绘制标准曲线：用HPLC
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ELSD分别测定3～4个用水稀释至不同浓度的对照品溶液，以缬氨酸峰面积的对数值与相应浓度值的对数值进行线性回归，得到缬氨酸的标准曲线和线性回归方程；c、样品测定与结果计算：将处理后的缬氨酸发酵液样品溶液注入HPLC
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ELSD测定，记录色谱图和峰面积，并用b步骤所得线性回归方程计算发酵样品溶液中前体物质缬氨酸的含量。
[0006]进一步的，所述发酵液中前体物质缬氨酸发酵液样品来自葡萄糖发酵工艺，其中含有大量的葡萄糖、蛋白质、脂类、微量元素等杂质。
[0007]进一步的，所述发酵液中前体物质缬氨酸发酵液样品溶液需要先净化除去杂质，具体制备方法为：(1)取缬氨酸发酵液进行离心，离心速度为3000～5000r/min，时间为5～15min；再取上清液10mL于50mL离心管中，加入乙腈10mL、硫酸镁2g、C
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1g和PSA 1g；经过振荡器震荡10min后离心，离心速度为3000～5000r/min，时间为10min；(2)取上清液于50mL旋蒸瓶中，40℃水浴旋转蒸发至干，用水溶解残渣并定容至5mL；(3)微孔滤膜过滤，得到缬氨酸样品溶液。
[0008]进一步的，所述缬氨酸对照品溶液以水溶解并稀释至质量浓度为1.0～2.0mg/mL，
再用水逐级稀释得到3～4个不同浓度的对照品溶液。
[0009]进一步的，所述HPLC
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ELSD进行测定的色谱条件如下：
[0010]色谱柱：C
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(4.6*250mm，5.0μm)；
[0011]柱温：30
±
5℃；
[0012]进样量：10～20μL；
[0013]流速：0.3～0.5mL/min；
[0014]漂移管温度：110～115℃；
[0015]增益系数：1；
[0016]气体流速：3.5L/min；
[0017]运行时间：35～45min；
[0018]流动相：三氟乙酸水溶液和乙腈的混合溶液；
[0019]进一步的，所述流动相中三氟乙酸水溶液的体积浓度为0.1％，所述乙腈的体积比例为2％～5％。
[0020]与现有技术相比，本专利技术所达到的有益效果是：本专利技术提供了一种实时检测缬氨酸的方法，能够准确检测发酵液中缬氨酸的含量，有效指征发酵过程中缬氨酸代谢过程，为发酵工艺调控提供有利依据。此外，本专利技术中发酵液样品不需要衍生处理，操作简便，准确高效易推广，可有效监控发酵过程中缬氨酸含量的变化，精准指导生产工艺调控，保证最终产品质量。
附图说明
[0021]附图用来提供对本专利技术的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本专利技术的实施例一起用于解释本专利技术，并不构成对本专利技术的限制。在附图中：
[0022]图1是本专利技术的实施例1的样品溶液的色谱图；
[0023]图2是本专利技术的实施例3的对照品溶液2的色谱图；
[0024]图3是本专利技术的实施例1的标准曲线图。
具体实施方式
[0025]下面将结合本专利技术实施例中的附图，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。
[0026]以下实施例中，材料来源如下：发酵液(自制发酵阿维拉霉素)；缬氨酸(CAS号：72
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18
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4，中国食品药品检定研究院)；乙腈(CAS号：75
‑
05
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8，国药)；PSA(沃特世科技有限公司)；C
18
(沃特世科技有限公司)；硫酸镁(CAS号：7487
‑
88
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9，麦克林)；三氟乙酸(CAS号：76
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05
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1，阿拉丁)
[0027]实施例1：
[0028]色谱条件
[0029]色谱柱：C
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(4.6*250mm，5.0μm)；
[0030]柱温：30
±
5℃；
[0031]进样量：20μL；
[0032]流速：0.3mL/min；
[0033]漂移管温度：110℃；
[0034]增益系数：1；
[0035]气体流速：3.5L/min；
[0036]运行时间：45min；
[0037]流动相：0.1％三氟乙酸水溶液：乙腈＝95:5；
[0038]a、制备缬氨酸对照品溶液：精密称取缬氨酸对照品10mg，用流动相溶解并稀释至质量浓度为1.0mg/mL，摇匀，作为对照品溶液1；将对照品溶液1用流动相溶液分别稀释2倍、4倍和10倍，得到对照品溶液2、对照品溶液3和对照品溶液4；
[0039]b、按照上述操作制备缬氨酸发酵液离心液，离心速度为3000r/min，时间为15min，用微孔滤膜过滤上清液，作为缬氨酸样品溶液；
[0040]c、绘制标准曲线：打开液相色谱仪，待仪器参数达到要求后，平衡基线40min，将4个对照品溶液依次进样，记录色谱图和峰本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种应用HPLC
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ELSD检测发酵液中前体缬氨酸的方法，其特征在于：包括以下步骤：a、制备缬氨酸对照品溶液和缬氨酸发酵液样品溶液；b、绘制标准曲线：用HPLC
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ELSD分别测定缬氨酸对照品溶液，以缬氨酸峰面积的对数值与相应浓度值的对数值进行线性回归，得到缬氨酸的标准曲线和线性回归方程；c、样品测定与结果计算：对缬氨酸发酵液进行处理，得到缬氨酸发酵液样品溶液，将缬氨酸发酵液样品溶液注入HPLC
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ELSD进行测定，记录色谱图和峰面积，并用b步骤所得线性回归方程计算缬氨酸发酵液样品溶液中前体物质缬氨酸的含量。2.根据权利要求1所述的一种应用HPLC
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ELSD检测发酵液中前体缬氨酸的方法，其特征在于：所述缬氨酸对照品溶液的制备方法：以水溶解并稀释至浓度为1.0～2.0mg/L，再用水逐级稀释得到不同浓度的缬氨酸对照品溶液。3.根据权利要求1所述的一种应用HPLC
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ELSD检测发酵液中前体缬氨酸的方法，其特征在于：所述缬氨酸发酵液样品溶液需要先净化去除杂质，具体制备方法为：取缬氨酸发酵液，离心后取上清液，加入乙腈、硫酸镁、C
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【专利技术属性】
技术研发人员：王瑶，马晓雨，杜石磊，张慧，
申请(专利权)人：河北圣雪大成制药有限责任公司，
类型：发明
国别省市：