构建阿尔兹海默症的兔模型方法技术

一种构建阿尔兹海默症的兔模型方法，属于动物生物技术领域。本发明专利技术的目的是利用CRISPR/Cas9技术将家兔的两个位点进行点突变，使得构建的双基因位点点突变的兔子呈现阿尔兹海默病表型的构建阿尔兹海默症的兔模型方法。本发明专利技术以兔MAPT基因11号外显子和/或PSEN1基因4号外显子为靶向，通过点突变的方式改变其遗传序列，使得兔子呈现阿尔兹海默症的表型。本发明专利技术为新一代药物筛选提供新思路，对研究阿尔兹海默病的病理过程对该疾病的预防和治疗具有指导意义。和治疗具有指导意义。

【技术实现步骤摘要】
构建阿尔兹海默症的兔模型方法


[0001]本专利技术属于动物生物


技术介绍

[0002]阿尔茨海默病（Alzheimer's disease，AD）是一种以进行性记忆功能衰退、认知行为障碍及其他神经精神症状为临床表现的神经退行性疾病，同时也是最常见的痴呆形式之一。该疾病不可逆转，且病情随时间进程加重，患者可能在确诊后的3
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9年死亡。其病理特征为广泛脑皮质萎缩、颞叶及海马等部位神经元丢失、老年斑、神经原纤维缠结以及神经炎症等。
[0003]近年来，AD的发病率较高，截至2021年全球痴呆患者人数已超5500万，其中 50%~75% 为AD患者。我国现有痴呆患者约900万人， 其中AD患者约 600万， 预计到 2030 年， 中国 AD患病者将超过1600万。据WHO估计，早在2015年，全球对痴呆症相关的投入就已经高达8180亿美元，占当年全球GDP1.1%。而AD作为痴呆症的主要类型，随着患病人数的与日俱增，给世界人民带来的经济压力及情感伤害也在日益增加，AD的防治工作已迫在眉睫。
[0004]AD 发病机制十分复杂，迄今尚未完全阐明。常见的关于AD致病机制的假说主要有β
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淀粉样蛋白（Aβ）假说、Tau蛋白假说、突触衰竭假说、神经营养因子假说、胆碱能缺失假说、氧化应激与自由基损伤假说、炎性免疫损伤假说等，其中以淀粉样蛋白（Aβ）假说和Tau蛋白假说研究最为深入，一直是AD致病机制最主流的两类猜测。此外，由Aβ蛋白错误堆积形成的神经斑块和Tau蛋白异常堆积形成的神经纤维缠结更加是AD最主要的病理类型，也是判断是否发病的重要标准。因此，构建影响Aβ蛋白和Tau蛋白的点突变动物模型对该疾病的研究与治疗至关重要。
[0005]编码tau蛋白的MAPT基因是MAPs蛋白家族成员，tau蛋白主要作用于轴突远端。正常情况下，tau是轴突中丰富的可溶性蛋白，促进微管和囊泡运输的组装和稳定。但是，当tau异常过度磷酸化和聚集就会降低对微管的亲和力，缠结成丝状包涵体，从而具有细胞毒性并损害认知。脑脊液中磷酸化tau和总tau水平是预测轻度认知障碍患者的早期阿尔茨海默病的生物学标志。
[0006]Aβ分子量约为4kDa，是由β淀粉样前体蛋白(β
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amyloid precursor protein,APP)经 β
‑
和 γ
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分泌酶的连续蛋白水解作用而产生的含有 39～43 个氨基酸的多肽。它可由多种细胞产生，循环于血液、脑脊液和脑间质液中，在细胞基质沉淀聚积后具有很强的神经毒性作用。其中γ
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分泌酶是由四种核心组蛋白组成的复合物，而PSEN1基因编码了核心蛋白之一的早老素1（Presenilin
‑
1），因此与Aβ的产生密切相关。
[0007]当PSEN1基因产生致病突变后，就会影响γ
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分泌酶的切割作用。APP有两条主要的加工途径：
①
淀粉样降解途径(10%)：β
‑
分泌酶(BACE1)首先在Aβ的氨基末端切割，产生Aβ
‑
N 端片段( sAPPβ) 和Aβ
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C 端片段（C99）。随后C99可以被多聚体天冬氨酸蛋白酶γ
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分泌酶切割生成Aβ。也有少数APP可以在Aβ结构域中被β分泌酶切割生成C89和截短的淀粉样蛋白。
②
非淀粉样降解途径(90%)：是大多数APP的切割途径。APP被α
‑
分泌酶切割产生sAPPα和
C83。C83进一步被γ
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分泌酶切割，产生胞外片段p3和胞内CTF。由于 α
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分泌酶的作用位点在Aβ 区域，从而阻止了 Aβ 的产生。两种加工途径都需要通过γ
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分泌酶进行切割，因此当其功能存在障碍时，就会造成Aβ蛋白的异常积累，从而诱发AD。
[0008]阿尔茨海默病的发展经历了长达几十年的临床前阶段，目前尚未得到有效的药物或治疗方法。造成这一结果的重要原因就是，AD的发病机制众多且相互交叉，盘根错节。想要攻克这一难题，了解清楚疾病的秘密，就需要我们找到合适的疾病模型进行研究。
[0009]此前最常使用的动物模型主要有两种：非灵长类的小鼠与灵长类动物。小鼠因其饲养成本低、繁殖速度快，一直广泛应用在各种疾病的动物模型构建中。但是，对于阿尔兹海默症，研究人员们发现，以往的小鼠模型不能模拟部分人类的疾病表型，如神经元丢失等。最近的研究结果证明，当将大鼠的APP基因完全人源化后，该大鼠可出现神经元丢失的表型，提示我们，此前在小鼠上进行临床实验的药物实际应用效果不好，很可能是因为该类模型与人类同源性低造成的。而灵长类动物，虽然与人类同源性更高，但其饲养成本高、繁殖困难，难以进行大规模实验。

技术实现思路

[0010]本专利技术的目的是利用CRISPR/Cas9技术将家兔的19号染色体上的MAPT基因的11号外显子的700号位点由脯氨酸突变为丝氨酸（即MAPT
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P700S），同时将20号染色体的PSEN1基因4号外显子上的第117号位点由脯氨酸突变为亮氨酸（即PSEN1
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P117L），使得构建的双基因位点点突变的兔子呈现相关表型的构建阿尔兹海默症的兔模型方法。
[0011]本专利技术以兔MAPT基因11号外显子和/或PSEN1基因4号外显子为靶向，通过点突变的方式改变其遗传序列，使得兔子呈现阿尔兹海默症的表型。
[0012]本专利技术靶向兔MAPT基因11号外显子2098bp处，变异类型为C>T，和/或PSEN1基因4号外显子350bp处，变异类型为C>T。
[0013]本专利技术步骤：（1）根据靶向位点设计与合成SgRNA；（2）受精卵的获取和显微注射注射卵泡刺激素，之后注射人绒毛膜促性腺激素，获取受精卵，通过显微注射仪器将预混合好的Cas9mRNA/sgRNA混合物注射到细胞质中，其中Cas9mRNA终浓度为150ng/μL；sgRNA终浓度为50ng/μL；（3）受精卵的体外培养和发育将显微注射的受精卵转移到培养液中，置于37℃恒温培养箱中培养，发育到桑椹胚时期时，用吸卵针将单个胚胎转移到离心管中，用于后面实验；（4）胚胎MAPT基因及PSEN1基因突变情况鉴定
①
胚胎裂解：胚胎裂解试剂为NP40，裂解条件为：56℃，1h；95℃，10min；
②
DNA测序鉴定胚胎基因型突变情况：以裂解产物为模板，使用PCR上游和下游引物进行PCR扩增，电泳鉴定，并进行DNA测序，得到基因型鉴定结果；a、设计PCR引物如下：MAPT基因上游引物：GACCCAGGAACCTGCATTT (Sense)MAPT基因下游引物：GACCCAGGCCGCTTTATT (AntiSense)
PSEN1基因上游引物：GGAGATAGAACTTGTGGTGA本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种构建阿尔兹海默症的兔模型方法，其特征在于：以兔MAPT基因11号外显子和/或PSEN1基因4号外显子为靶向，通过点突变的方式改变其遗传序列，使得兔子呈现阿尔兹海默症的表型。2.根据权利要求1所述的构建阿尔兹海默症的兔模型方法，其特征在于：靶向兔MAPT基因11号外显子2098bp处，变异类型为C>T，和/或PSEN1基因4号外显子350bp处，变异类型为C>T。3.根据权利要求1所述的构建阿尔兹海默症的兔模型方法，其特征在于：其步骤：（1）根据靶向位点设计与合成SgRNA；（2）受精卵的获取和显微注射注射卵泡刺激素，之后注射人绒毛膜促性腺激素，获取受精卵，通过显微注射仪器将预混合好的Cas9mRNA/sgRNA混合物注射到细胞质中，其中Cas9mRNA终浓度为150ng/μL；sgRNA终浓度为50ng/μL；（3）受精卵的体外培养和发育将显微注射的受精卵转移到培养液中，置于37℃恒温培养箱中培养，发育到桑椹胚时期时，用吸卵针将单个胚胎转移到离心管中，用于后面实验；（4）胚胎MAPT基因及PSEN1基因突变情况鉴定
①
胚胎裂解：胚胎裂解试剂为NP40，裂解条件为：56℃，1h；95℃，10min；
②
DNA测序鉴定胚胎基因型突变情况：以裂解产物为模板，使用PCR上游和下游引物进行PCR扩增，电泳鉴定，并进行DNA测序，得到基因型鉴定结果；a、设计PCR引物如下：MAPT基因上游引物：GACCCAGGAACCTGCATTT (Sense)MAPT基因下游引物：GACCCAGGCCGCTTTATT (AntiSense)PSEN1基因上游引物：GGAGATAGAACTTGTGGTGAGG (Sense)PAEN1基因下游引物：TAGAGAACCACCAGGAGGATAG (AntiSense)b、PCR反应体系如下：DNA模板
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2μL上游引物
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1μL下游引物
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1μL2
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Ta...

【专利技术属性】
技术研发人员：李占军，刘若楠，宋宇宁，赖良学，王东旭，
申请(专利权)人：吉林大学，
类型：发明
国别省市：