一种调控昆虫体内病毒增殖的方法技术

本发明专利技术公开了一种调控昆虫体内病毒增殖的方法，即通过靶向调控昆虫体内3，5

【技术实现步骤摘要】
一种调控昆虫体内病毒增殖的方法


[0001]本专利技术涉及一种通过靶向调控3，5
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二磷酸磷脂酰肌醇(PI(3，5)P2)含量进而控制昆虫体内病毒增殖的方法，属于生物


技术介绍

[0002]磷脂是细胞膜的重要组分，可分为甘油磷脂和鞘磷脂。甘油磷脂又可以根据极性头部基团不同分为磷脂酰肌醇、磷脂酰胆碱等。磷脂酰肌醇头部的肌醇环3位，4位和5位被磷酸化后可形成磷酸肌醇。磷脂酰肌醇的肌醇环3位和5位被磷酸化后形成3，5
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二磷酸磷脂酰肌醇(PI(3，5)P2)。PI(3，5)P2在真核细胞中的功能至关重要。酵母和动物中的研究表明PI(3，5)P2影响液泡、内体及溶酶体形态，并且与内膜稳态的维持密切相关，还可调控渗透、液泡pH及自噬等过程，但目前尚未有利用PI(3，5)P2调控昆虫体内病毒增殖的报道。
[0003]植物病毒病已成为农业生产中的第二大病害，每年对全球农业生产造成巨大经济损失。植物感染病毒病后基本无法治愈，极易带来毁灭性后果，如本世纪以来由灰飞虱传播水稻条纹病毒(RSV)和水稻黑条矮缩病毒(RBSDV)引起的水稻条纹叶枯病和水稻黑条矮缩病在我国稻麦轮作区相继暴发流行，2005年江苏、安徽等地发病面积4000余万亩，给水稻生产、粮食安全和农村稳定造成严重影响。植物病毒种类繁多，目前已知的植物病毒约有1100种，其中76％以上的植物病毒通过媒介昆虫传播。此外，媒介昆虫还可以传播多种人类疾病，如蚊虫传播疟疾、登革热等多种传染病，严重危害人类健康。对于媒介昆虫传播的持久增殖型植物病毒而言，病毒需在昆虫体内增殖至一定的积累量后才可将病毒有效传播至植物上。因此，寻找调控昆虫体内病毒增殖的有效方法对于控制昆虫传播的病毒病具有重要作用。
[0004]稻飞虱是水稻上的重要害虫，通过刺吸水稻茎干和叶片危害，虫量大时可造成植株干枯和大面积枯死倒伏，俗称“虱烧”。除刺吸危害外，稻飞虱还传播多种水稻病毒病，引起巨大损失。在我国发生危害的稻飞虱主要有褐飞虱、白背飞虱和灰飞虱。灰飞虱不仅传播玉米粗缩病，还传播水稻条纹叶枯病和水稻黑条矮缩病。褐飞虱可传播水稻齿叶矮缩病和水稻草矮病。白背飞虱传播南方水稻黑条矮缩病，2001年首次在我国广东省发现，2009年在我国广东、江西、湖南等9个省份大面积暴发，受害面积约33.33万hm2，2010年受害面积达133万hm2。这些病毒病害给水稻生产造成了严重威胁。本专利技术以稻飞虱为实施对象，通过注射PI(3，5)P2的抑制剂YM201636或PI(3，5)P2合成酶基因的dsRNA，显著抑制了稻飞虱体内病毒的增殖；通过注射PI(3，5)P2的同源物PI(3，5)P2‑
diC8后，稻飞虱体内病毒的积累量显著增加。
[0005]本专利技术通过外源施加PI(3，5)P2抑制剂或PI(3，5)P2合成酶基因的dsRNA，抑制昆虫体内病毒的增殖；采用外源施加PI(3，5)P2的同源化合物PI(3，5)P2‑
diC8，促进昆虫体内病毒的增殖。本专利技术为控制媒介昆虫传毒提供了新技术和新方法。

技术实现思路

[0006]本专利技术提供了一种通过靶向PI(3，5)P2调控昆虫体内病毒增殖的方法，该方法通过PI(3，5)P2的抑制剂、PI(3，5)P2合成酶基因的dsRNA及PI(3，5)P2的同源物PI(3，5)P2‑
diC8处理调控PI(3，5)P2的含量，进而控制昆虫体内病毒增殖。
[0007]具体内容的方法和步骤如下：
[0008]1、通过外源施加PI(3，5)P2抑制剂YM201636抑制昆虫体内病毒的增殖。具体方法为：
[0009](1)采用DMSO溶解YM201636配成浓度10mM的母液。使用时用PBS缓冲液将YM201636母液稀释500～1000倍，稀释成10～20μM使用浓度，同时将DMSO用PBS溶液稀释500～1000倍作为对照溶液。
[0010](2)采用显微注射、点滴或喷雾等方法用PBS稀释后的YM201636溶液处理携带病毒的昆虫，用PBS稀释后的DMSO溶液处理作为对照。
[0011](3)YM201636处理4～10天后，采用荧光定量、免疫荧光、western blot等方法检测病毒积累量。
[0012]2、通过外源施加PI(3，5)P2合成酶基因的dsRNA，抑制昆虫体内病毒的增殖。具体方法为：
[0013](1)设计特异性引物，扩增PI(3，5)P2合成酶基因PIKfyve及对照基因GFP的基因片段。
[0014](2)采用dsRNA合成PI(3，5)P2合成酶基因PIKfyve的dsRNA，同时合成GFP基因的dsRNA。
[0015](3)采用显微注射方法将dsRNA注射至携带病毒的昆虫体内。
[0016](4)dsRNA处理后，采用荧光定量、免疫荧光、western blot等方法检测病毒积累量。
[0017]3、通过外源施加PI(3，5)P2‑
diC8促进昆虫体内病毒的增殖。具体方法为：
[0018](1)将商业化的PI(3，5)P2‑
diC8用DMSO配成1mM母液，使用时用PBS缓冲液将PI(3，5)P2‑
diC8母液稀释1000～10000倍，稀释成1nM～1μM使用浓度，同时将DMSO用PBS溶液稀释1000～10000倍作为对照溶液。
[0019](2)采用显微注射、点滴或喷雾等方法用PBS稀释后的YM201636溶液处理携带病毒的昆虫，对照溶液为PBS稀释后的DMSO溶液。
[0020](3)PI(3，5)P2‑
diC8溶液处理4～10天后，采用荧光定量、免疫荧光、western blot等方法检测病毒积累量。
[0021]以上所述本
技术实现思路
的技术方案不针对所有病毒。对于本领域的技术人员来说，本专利技术可以换用PI(3，5)P2的其他抑制剂以抑制PI(3，5)P2的含量或施加其他PI(3，5)P2同源化合物增加昆虫体内PI(3，5)P2的含量。本专利技术采用的溶液浓度可依据实际病毒增殖效果等情况进行调整。凡在本专利技术原则之内所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本专利技术的保护范围之内。
附图说明
[0022]图1为实施例1中YM201636处理携带RBSDV的灰飞虱后采用荧光定量PCR(A)和
western blot(B)方法检测病毒积累量
[0023]图2为实施例2中携带RBSDV的灰飞虱注射PI(3，5)P2合成酶PIKfyve基因和eGFP的dsRNA后采用荧光定量PCR(A)和western blot(B)方法检测病毒积累量
[0024]图3为实施例3中YM201636处理携带SRBSDV的白背飞虱后采用荧光定量PCR(A)和western blot(B)方法检测病毒积累量
[0025]图4为实施例4中PI(3，5)P2‑
diC8处理携带RBSDV的灰飞虱后采用荧光定量PCR(A)和we本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种调控昆虫体内病毒增殖的方法，其特征在于：通过靶向调控3，5
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二磷酸磷脂酰肌醇(PI(3，5)P2)的含量控制昆虫体内病毒增殖。2.根据权利要求1的方法，其中所述靶向调控PI(3，5)P2含量的方法包括采用显微注射、点滴...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐秋芳，王海涛，董岩，
申请(专利权)人：江苏省农业科学院，
类型：发明
国别省市：