一种酸性条件下识别大肠杆菌的链状脱氧核酶探针与应用制造技术

本发明专利技术公开了一种酸性条件下识别大肠杆菌的链状脱氧核酶探针与应用，属于脱氧核酶探针技术领域。将磷酸化的文库酶链、底物链和连接链在T4DNA连接酶的作用下连接，构建链状DNA文库，进行反向筛选，分离纯化未切割底物RNA位点的DNA条带，所得的DNA条带作为链状DNA文库，进行正向筛选，分离纯化切割底物RNA位点的DNA条带，进行PCR扩增，回收正义链，进行多轮重复筛选，得到链状脱氧核酶探针，该探针能够高特异性、快速地检测大肠杆菌，具有在生物传感应用方面发挥优势的潜力。用方面发挥优势的潜力。用方面发挥优势的潜力。

【技术实现步骤摘要】
一种酸性条件下识别大肠杆菌的链状脱氧核酶探针与应用


[0001]本专利技术属于脱氧核酶探针
，具体涉及一种酸性条件下识别大肠杆菌的链状脱氧核酶探针与应用。

技术介绍

[0002]脱氧核酶(DNAzymes)是通过体外指数富集配体系统进化技术(SELEX技术)筛选出的一种单链DNA片段，可以特异性地识别目标分子且具有催化功能。
[0003]1994年，Breaker和Joyce发现了第一个DNAzyme。相比于RNA酶，尽管DNAzyme缺乏2
’‑
羟基，而且它的发现比RNA酶晚了十多年，但也可以催化一系列不同的反应，包括RNA切割、DNA切割、RNA连接、磷酸化、脱糖基化、磷酸化、胸腺嘧啶二聚体的光切割和卟啉金属化等。与RNA或蛋白质相比，DNAzyme有几个显著的优点：首先是更稳定，水解的稳定性是RNA的100000倍，DNA磷酸二酯键对水解降解的抵抗力也是肽键的1000倍；其次，DNA很容易制备，价格便宜。当然，它还可以通过PCR直接扩增(而RNA必须首先被反转录)，可以通过固定在溶液中或者物质表面发挥作用，并且可以很容易地进行化学修饰，以增加稳定性或额外的功能部分。因此，DNAzyme可以补充和扩展可以适用于合成酶的应用类型。此外，对比双链DNA，由于酶活性位点必须精确排列催化基团和反应基团，以降低给定反应的活化能垒，需要一定程度的结构复杂性——而这是典型的双链螺旋DNA无法提供的。因此，单链DNA可以获得更多类型的二级和三级相互作用，如非标准碱基对、发夹环、内部凸起、多茎连接和堆叠的G
‑
四链体结构等。这些额外的相互作用有助于形成更复杂的结构，使DNAzyme成为更好的催化活性分子。在所有的DNAzyme中，裂解RNA的DNAzyme(RNA
‑
cleaving DNAzyme，RCD)应用又最为广泛，因为它们相对容易分离，体积较小，反应速度快，并且可以使用多种信号转导方法得到。它利用金属离子或小分子作为辅助因子进行结构折叠和化学催化。
[0004]在致病菌的检测方法中，传统的微生物培养方法费时费力，免疫、PCR方法则存在步骤繁琐、需要特定的设备等的缺点。例如，在抗体检测中，需要较长的时间获得合适的抗体进行检测设计，而且抗体的稳定性低于核酸探针，容易受到酶及物理环境的干扰。DNAzyme由于其高特异性、快速、廉价、灵敏等特点得到了广泛的研究，越来越多的RCDs被用于设计生物传感器和生物检测方法，以此检测食源性、水体或临床中的重要病原体。目前，所有已知的细菌性RCDs都被报道在或接近生理条件下发挥作用，如中性pH、温和温度(室温至37℃)和含二价金属离子(如Mg
2+
)的水溶液。众所周知，RCDs可以在低pH、高/低温度或有机溶剂条件下直接进行筛选进化；然而，尚无在非常规的反应条件下对细菌性RCDs进行体外筛选的研究。
[0005]综上所述，有必要寻找在非常规条件下具有识别和催化能力的核酶和脱氧核酶，这将对未来的体外筛选研究具有指导性意义，并进一步扩大DNAzyme在极端条件下工作、应用的范围。此外，非常规条件的DNAzyme将增加DNAzyme自身的生物稳定性与化学稳定性，并补充现有大肠杆菌DNAzyme的不足，为未来大肠杆菌纸基器件的发展奠定基础，从而推动功能核酸实际应用于病原菌检测，尤其对于偏远地区病原菌检测、即时检测及预防大规模病
原菌爆发有着重大理论和实际意义。

技术实现思路

[0006]为了实现目标细菌(大肠杆菌)能够快速、灵敏、稳定检测的技术问题，本专利技术的目的是通过设计的筛选方案获得在酸性条件下可识别大肠杆菌的链状脱氧核酶探针。通过体外筛选得到可被特定大肠杆菌激活的酸性RCDs，在含有一价金属离子的酸性溶液(50mM HEPES，150mM NaCl，50mM KCl，0.01％Tween 20；pH 5.3)中具有催化活性。
[0007]选择具有一价金属离子作为所需的辅助因子有几个优点。首先，可以提高底物中RNA磷酸二酯键的化学稳定性。研究发现，在典型的生理条件下(如37℃，pH 7.4，50mM KCl和5mM MgCl2)，RNA降解的速率常数大约是类似的pH 6条件下速率常数的10倍。因此，去掉二价金属离子可以强烈抑制RNA的酯交换降解。此外，这些仅仅依赖一价金属离子的RCDs在生物环境中具有更强的生物稳定性，因为它们更耐普遍存在的天然核酸酶的非特异性降解。这些核酸酶通常在生理条件下与所需的二价金属离子(如Mg
2+
和Ca
2+
)共同作用降解RNA。综合起来，这些特性可以保护RCDs免受内部的化学不稳定性和外部的核酸酶降解，非常适合于生产实际诊断中的生物传感器。
[0008]本专利技术通过以下方式实现目的：
[0009]本专利技术提供一种脱氧核酶探针，所述脱氧核酶探针的核苷酸序列为如下序列(1)～(7)中的任一：
[0010](1)CTATGAACTGACQRFGACCTCACTACCAAGCAGGTCCATCGAGTGGTAGGATGAGGGGTTACTAGCTAGAGCGTAAGCCTTCGGCGGTCAGTCGCACTGCTCCTGAACGTAC；
[0011](2)CTATGAACTGACQRFGACCTCACTACCAAGCAGGTCCATCGAGTGGTAGGAGCGGATCCGGGACTAGTAAGCGGAGTTCAGGAATAATGACTCGCACTGCTCCTGAACGTAC；
[0012](3)CTATGAACTGACQRFGACCTCACTACCAAGCAGGTCCATCGAGTGGTAGGAGGCCCAGTATATGTAGGGATCGTATGGAAAGGCAGAGCACTCGCACTGCTCCTGAACGTAC；
[0013](4)CTATGAACTGACQRFGACCTCACTACCAAGCAGGTCCATCGAGTGGTAGGAGGGCTCACCGGTATAGGCGGGAGAGTACGGAGGAATTGGCTCGCACTGCTCCTGAACGTAC；
[0014](5)在SEQ ID NO.13所示的核苷酸序列的5
’
端连接荧光基团；
[0015](6)SEQ ID NO.14所示的核苷酸序列；
[0016](7)在SEQ ID NO.15所示的核苷酸序列的5
’
端连接荧光基团；
[0017]其中，R代表单个插入的RNA碱基A，F代表含有荧光基团的T碱基，Q代表含有淬灭基团的T碱基。
[0018]所述SEQ ID NO:13是通过对SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列进行截断优化，且仍能保持和SEQ ID NO:1所示的链状脱氧核酶探针相同的或更优的催化速率。
[0019]所述SEQ ID NO:14是通过对SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列进行截断优化，且仍能保持和SEQ ID NO:1所示的链状脱氧本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种脱氧核酶探针，其特征在于，所述脱氧核酶探针的核苷酸序列为如下序列(1)～(7)中的任一：(1)CTATGAACTGACQRFGACCTCACTACCAAGCAGGTCCATCGAGTGGTAGGATGAGGGGTTACTAGCTAGAGCGTAAGCCTTCGGCGGTCAGTCGCACTGCTCCTGAACGTAC；(2)CTATGAACTGACQRFGACCTCACTACCAAGCAGGTCCATCGAGTGGTAGGAGCGGATCCGGGACTAGTAAGCGGAGTTCAGGAATAATGACTCGCACTGCTCCTGAACGTAC；(3)CTATGAACTGACQRFGACCTCACTACCAAGCAGGTCCATCGAGTGGTAGGAGGCCCAGTATATGTAGGGATCGTATGGAAAGGCAGAGCACTCGCACTGCTCCTGAACGTAC；(4)CTATGAACTGACQRFGACCTCACTACCAAGCAGGTCCATCGAGTGGTAGGAGGGCTCACCGGTATAGGCGGGAGAGTACGGAGGAATTGGCTCGCACTGCTCCTGAACGTAC；(5)在SEQ ID NO.13所示的核苷酸序列的5
’
端连接荧光基团；(6)SEQ ID NO.14所示的核苷酸序列；(7...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘猛，周沁彬，常洋洋，
申请(专利权)人：大连理工大学，
类型：发明
国别省市：