具有工程化的双引导核酸的CRISPR系统技术方案

本发明专利技术涉及一种工程化的成簇规律间隔的短回文重复序列(CRISPR)系统，所述系统包含能够激活CRISPR相关(Cas)核酸酶如V

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】具有工程化的双引导核酸的CRISPR系统
[0001]相关申请
[0002]本申请要求2019年10月3日提交的美国临时专利申请号62/910,055的权益和优先权，所述申请的公开内容特此出于所有目的以引用的方式整体并入。


[0003]本专利技术涉及一种工程化的成簇规律间隔的短回文重复序列(CRISPR)系统，所述系统包含能够激活CRISPR相关(Cas)核酸酶的工程化的双引导核酸(例如，RNA)；使用所述工程化的CRISPR系统靶向、编辑和/或修饰核酸的方法；以及包含所述工程化的CRISPR系统的组合物和细胞。
[0004]专利技术背景
[0005]在精确基因组靶向技术方面已经取得了最新进展。例如，基因组DNA中的特定基因座可通过设计者大范围核酸酶、锌指核酸酶或转录激活因子样效应物(TALE)靶向、编辑或以其他方式修饰。此外，细菌和古细菌适应性免疫的CRISPR
‑
Cas系统已适于精确靶向真核细胞中的基因组DNA。与前几代基因组编辑工具相比，CRISPR
‑
Cas系统易于设置、可扩展且适合于靶向真核基因组内的多个位置，从而为基因组工程化中的新应用提供主要资源。
[0006]已经鉴定了两类不同的CRISPR
‑
Cas系统。1类CRISPR
‑
Cas系统利用多蛋白效应物复合物，而2类CRISPR
‑
Cas系统利用单蛋白效应物(参见Makarova等人(2017)C
ELL
,168:328)。在三种类型的2类CRISPR
‑
Cas系统中，II型和V型系统通常靶向DNA，并且VI型系统通常靶向RNA(同上)。天然存在的II型效应物复合物由Cas9、CRISPR RNA(crRNA)和反式激活CRISPR RNA(tracrRNA)组成，但为了简单起见，crRNA和tracrRNA可在工程化的系统中融合为单引导RNA(参见，Wang等人(2016)A
NNU
.R
EV
.B
IOCHEM
.,85:227)。某些天然存在的V型系统(如V
‑
A型、V
‑
C型和V
‑
D型系统)不需要tracrRNA并使用单独crRNA作为靶DNA裂解的向导(参见Zetsche等人(2015)C
ELL
,163:759；Makarova等人(2017)C
ELL
,168:328)。
[0007]CRISPR
‑
Cas系统已被工程化用于各种目的，如基因组DNA裂解、碱基编辑、表观基因组编辑和基因组成像(参见例如，Wang等人(2016)A
NNU
.R
EV
.B
IOCHEM
.,85:227和Rees等人(2018)N
AT
.R
EV
.G
ENET
.,19:770)。尽管已经取得了重大进展，但仍然需要新的且有用的CRISPR
‑
Cas系统作为强大的精确基因组靶向工具。

技术实现思路

[0008]本专利技术部分地基于双引导CRISPR
‑
Cas系统的设计，其中靶向子核酸和调节子核酸在杂交以形成复合物时可激活Cas核酸酶，所述Cas核酸酶在天然存在的系统中在不存在tracrRNA的情况下被单个crRNA激活。本文所述的工程化的双引导CRISPR
‑
Cas系统可用于靶向、编辑或修饰靶核酸，如基因组DNA。
[0009]V
‑
A型、V
‑
C型和V
‑
D型CRISPR
‑
Cas系统天然地包含Cas核酸酶和单引导RNA(即，crRNA)。通过将单引导RNA分裂成两种不同的核酸，本文所述的工程化的系统提供更好的灵活性和可调性。例如，可通过调整杂交长度和/或所述靶向子核酸和所述调节子核酸的亲和
力来提高或降低核酸裂解的效率。此外，鉴于可以高产率和准确度合成的核酸的长度限制，使用双引导核酸允许并入更多的多核苷酸元件，所述多核苷酸元件可提高编辑效率和/或特异性。
[0010]特别地，所述双引导系统可被工程化为可调系统以减少脱靶编辑，并且因此可用于编辑具有高特异性的核酸。所述系统可用于许多应用中，例如，编辑用于疗法中的细胞，如哺乳动物细胞。当创建遗传工程化的增殖细胞(如干细胞、祖细胞和免疫记忆细胞)以施用于需要所述疗法的受试者时，脱靶编辑的减少是特别令人希望的。使用本文所述的双引导系统可实现高特异性，所述双引导系统任选地还包含例如对所述靶向子核酸和/或所述调节子核酸的一种或多种化学修饰、编辑增强子序列和/或供体模板募集序列。
[0011]因此，在一个方面，本专利技术提供了一种工程化的非天然存在的系统，所述工程化的非天然存在的系统包含：
[0012](a)靶向子核酸，所述靶向子核酸包含：
[0013](i)被设计为与靶核苷酸序列杂交的间隔区序列；和
[0014](ii)靶向子茎序列；以及
[0015](b)调节子核酸，所述调节子核酸包含与所述靶向子茎序列互补的调节子茎序列，
[0016]其中所述靶向子核酸和所述调节子核酸是单独的核酸，并且其中包含所述靶向子核酸和所述调节子核酸的复合物能够激活CRISPR相关(Cas)核酸酶，所述核酸酶在天然存在的系统中在不存在tracrRNA的情况下被单个crRNA激活。
[0017]在某些实施方案中，所述Cas核酸酶是V
‑
A型Cas核酸酶。
[0018]在某些实施方案中，所述靶向子茎序列和所述调节子茎序列的长度各自是4
‑
10个核苷酸。在某些实施方案中，所述靶向子茎序列和所述调节子茎序列的长度各自是5个核苷酸。在某些实施方案中，所述靶向子茎序列和所述调节子茎序列通过沃森
‑
克里克碱基配对杂交。
[0019]在某些实施方案中，所述间隔区序列的长度是约20个核苷酸。
[0020]在某些实施方案中，所述间隔区序列的长度是18个核苷酸或更短。
[0021]在某些实施方案中，所述间隔区序列的长度是17个核苷酸或更短。
[0022]在某些实施方案中，所述靶向子核酸从5
’
至3
’
包含所述靶向子茎序列、所述间隔区序列和任选的另外核苷酸序列。
[0023]在某些实施方案中，所述靶向子核酸包含核糖核酸(RNA)。在某些实施方案中，所述靶向子核酸包含经修饰的RNA。在某些实施方案中，所述靶向子核酸包含RNA和DNA的组合。在某些实施方案中，所述靶向子核酸包含化学修饰。在某些实施方案中，所述化学修饰存在于所述靶向子核酸的3
’
端的一个或多个核苷酸中。在某些实施方案中，所述化学修饰选自由以下组成的组：2'
‑...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种工程化的非天然存在的系统，所述系统包含：(a)靶向子核酸，所述靶向子核酸包含：(i)被设计为与靶核苷酸序列杂交的间隔区序列；和(ii)靶向子茎序列；以及(b)调节子核酸，所述调节子核酸包含与所述靶向子茎序列互补的调节子茎序列，其中所述靶向子核酸和所述调节子核酸是单独的核酸，并且其中包含所述靶向子核酸和所述调节子核酸的复合物能够激活CRISPR相关(Cas)核酸酶，所述核酸酶在天然存在的系统中在不存在tracrRNA的情况下被单个crRNA激活。2.如权利要求1所述的工程化的非天然存在的系统，其中所述Cas核酸酶是V
‑
A型Cas核酸酶。3.如权利要求1或2所述的工程化的非天然存在的系统，其中所述靶向子茎序列和所述调节子茎序列的长度各自是4
‑
10个核苷酸。4.如权利要求1
‑
3中任一项所述的工程化的非天然存在的系统，其中所述靶向子茎序列和所述调节子茎序列的长度各自是5个核苷酸。5.如前述权利要求中任一项所述的工程化的非天然存在的系统，其中所述靶向子茎序列和所述调节子茎序列通过沃森
‑
克里克碱基配对杂交。6.如权利要求1
‑
5中任一项所述的工程化的非天然存在的系统，其中所述间隔区序列的长度是约20个核苷酸。7.如权利要求1
‑
5中任一项所述的工程化的非天然存在的系统，其中所述间隔区序列的长度是18个核苷酸或更短。8.如权利要求7所述的工程化的非天然存在的系统，其中所述间隔区序列的长度是17个核苷酸或更短。9.如前述权利要求中任一项所述的工程化的非天然存在的系统，其中所述靶向子核酸从5
’
至3
’
包含所述靶向子茎序列、所述间隔区序列和任选的另外核苷酸序列。10.如前述权利要求中任一项所述的工程化的非天然存在的系统，其中所述靶向子核酸包含核糖核酸(RNA)。11.如权利要求10所述的工程化的非天然存在的系统，其中所述靶向子核酸包含经修饰的RNA。12.如权利要求10或11所述的工程化的非天然存在的系统，其中所述靶向子核酸包含RNA和DNA的组合。13.如权利要求10
‑
12中任一项所述的工程化的非天然存在的系统，其中所述靶向子核酸包含化学修饰。14.如权利要求13所述的工程化的非天然存在的系统，其中所述化学修饰存在于所述靶向子核酸的3
’
端的一个或多个核苷酸中。15.如权利要求13或14所述的工程化的非天然存在的系统，其中所述化学修饰选自由以下组成的组：2'
‑
O
‑
甲基、2'
‑
氟、2'
‑
O
‑
甲氧基乙基、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、假尿苷以及它们的任何组合。16.如前述权利要求中任一项所述的工程化的非天然存在的系统，其中所述调节子核酸还包含另外的核苷酸序列。
17.如权利要求16所述的工程化的非天然存在的系统，其中所述另外的核苷酸序列位于所述调节子茎序列的5
’
。18.如权利要求16或17所述的工程化的非天然存在的系统，其中所述另外的核苷酸序列的长度是4
‑
50个核苷酸。19.如权利要求16
‑
18中任一项所述的工程化的非天然存在的系统，其中所述另外的核苷酸序列包含能够与供体模板杂交的供体模板募集序列。20.如权利要求19所述的工程化的非天然存在的系统，所述工程化的非天然...

【专利技术属性】
技术研发人员：R，
申请(专利权)人：丹麦科技大学，
类型：发明
国别省市：