真菌来源的强启动子及其应用制造技术

本发明专利技术涉及真菌中具有启动子活性的多核苷酸及其在生产有机酸、酶制剂中的用途、含有多核苷酸的转录表达盒、重组载体、重组宿主细胞，以及利用启动子活性的多核苷酸在增强目标基因表达中的应用，进而例如可以提高菌株的有机酸、酶制剂的产量。酶制剂的产量。

【技术实现步骤摘要】
真菌来源的强启动子及其应用


[0001]本专利技术涉及生物工程和基因工程
，涉及具有启动子活性的多核苷酸，以及利用启动子活性的多核苷酸增强目标基因表达的方法、提高菌株有机酸或酶制剂产量的方法。

技术介绍

[0002]真菌是生物产业领域极为重要的工业菌株，广泛用于有机酸、酶制剂等工业生产。以黑曲霉为例，黑曲霉是有机酸与酶制剂产业极为重要的工业菌株，黑曲霉生产的柠檬酸全球年产量达200万吨，产值超过20亿美元，并以每年5％的速度递增。2015年全球真菌酶制剂的产值约35亿欧元。
[0003]众所周知，目标基因的高效表达是实现真菌高产有机酸和酶制剂的关键，而影响基因高效表达的因素主要有启动子活性、翻译效率、基因拷贝数等，基因拷贝数的增加会降低菌种基因组的稳定性，因此，启动子转录水平的高低是影响基因高效表达的关键因素。
[0004]目前，已有文献报道了真菌中的强启动子，如构巢曲霉三磷酸甘油醛脱氢酶gpdA启动子，泡盛曲霉谷氨酸脱氢酶gdhA启动子等(雷达，许杨等，曲霉属蛋白表达中高效启动子的应用研究[J]，食品工业科技，2013，34(13)：342－345)，其中，来源于构巢曲霉的gpdA启动子是目前已报道的商业化较好且普遍认为是真菌中的强启动子。Xu等(Xu Y，Zhou Y，Cao W，Liu H.Improved Production of Malic Acid in Aspergillus niger by Abolishing Citric Acid Accumulation and Enhancing Glycolytic Flux.ACS Synth Biol.2020.9(6):1418
‑
1425)利用该启动子来强化糖酵解途径后，使苹果酸/葡萄糖的转化率从1.27mol/mol提高至1.64mol/mol，从而提高了苹果酸的产量。
[0005]然而，目前还需要丰富适用于各种不同用途的启动子活性的核酸分子。比如，开发活性更高的启动子或比较适用于相关用途的启动子，将有利于增强有机酸合成相关基因的表达，增强酶制剂的表达，从而更具工业应用潜力。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的在于提供一种来源于真菌的具有强启动子活性的多核苷酸序列，该具有强启动子活性的多核苷酸能够提高有机酸相关基因、酶制剂编码基因的表达强度，从而提高有机酸、酶制剂的产量，更具有工业应用潜能。在此基础上，完成了本专利技术。
[0007]一方面，本专利技术提供了一种具有强启动子活性的多核苷酸，其中，所述多核苷酸选自如下(a)
‑
(e)中组成的组中的任一项：
[0008](a)包括如SEQ ID NO：1
‑
5任一序列所示的核苷酸序列；
[0009](b)包括如SEQ ID NO：54
‑
60任一序列所示的核苷酸序列；
[0010](c)包含如SEQ ID NO：1
‑
5、SEQ ID NO：54
‑
60任一序列所示的核苷酸序列的反向互补序列；
[0011](d)在高严格性杂交条件下，能够与(a)或(b)或(c)所示的核苷酸序列杂交的序
列，并仍具有启动子活性；
[0012](e)与(a)或(b)或(c)所示的核苷酸序列具有至少90％，可选至少95％，优选至少97％，更优选至少98％，最优选至少99％的序列同一性，且仍具有启动子活性的序列。
[0013]优选地，具有启动子活性的多核苷酸是核苷酸序列如SEQ ID NO：1
‑
5、SEQ ID NO：54
‑
60任一序列所示的多核苷酸。
[0014]第二方面，本专利技术提供了一种转录表达盒，其中，所述转录表达盒包括第一方面的启动子，可选地，所述转录表达盒还含有蛋白编码基因，所述蛋白编码基因与所述具有启动子活性的多核苷酸可操作地连接。
[0015]第三方面，本专利技术提供了一种重组表达载体，其中，所述重组表达载体包括第一方面所述的核苷酸序列或第二方面所述的转录表达盒。
[0016]第四方面，本专利技术提供了一种宿主细胞，其中，所述宿主细胞中含有第二方面的转录表达盒，或第三方面的重组表达载体；其中，所述宿主细胞是真菌，可选地，所述宿主细胞为黑曲霉(Aspergillus niger)，构巢曲霉(Aspergillus nidulans)，米曲霉(Aspergillus oryzae)，产黄青霉(Penicillium chrysogenum)，里氏木霉(Trichoderma reesei)，玉蜀黍黑粉菌(Ustilago maydis)，嗜热毁丝霉(Myceliophthora thermophila)，最优选黑曲霉(Aspergillus niger)，构巢曲霉(Aspergillus nidulans)。
[0017]第五方面，本专利技术提供了第一方面所述的多核苷酸，第二方面的转录表达盒，第三方面的重组表达载体，第四方面的宿主细胞在如下至少一种中的用途：
[0018](a)用于增强基因的转录水平，或制备用于增强基因的转录水平的试剂或试剂盒；
[0019](b)用于制备蛋白，或制备用于制备蛋白的试剂或试剂盒；
[0020](c)生产有机酸，或制备用于生产有机酸的试剂或试剂盒。
[0021]可选地，所述有机酸包括柠檬酸、琥珀酸、苹果酸中的任一种。所述蛋白为酶制剂，所述酶制剂包括葡糖淀粉酶、葡萄糖氧化酶、过氧化氢酶与植酸酶中的任一种。
[0022]第六方面，本专利技术提供了一种调控目标基因转录的方法，其中，所述方法包括将第一方面的具有启动子活性的多核苷酸与目标基因可操作地连接，例如通过将所述启动子活性的多核苷酸与目标基因可操作地连接的载体导入重组宿主细胞，增强所述重组宿主细胞中的目标基因的转录。
[0023]第七方面，本专利技术提供了一种制备蛋白的方法，其中，所述方法包括利用含有目标基因的第二方面的表达盒，或含有目标基因的第三方面的重组表达载体，导入重组宿主细胞以表达目标基因，或培养第四方面的宿主细胞以表达蛋白。
[0024]第八专利技术，本专利技术提供了一种有机酸或酶制剂的生产方法，其中，所述方法包括利用第二方面的表达盒，或第三方面的重组表达载体，导入宿主细胞，培养所述宿主细胞，收集产生的有机酸或酶，其中所述表达盒或重组表达载体中含有与第一方面所述的核苷酸可操作连接的编码与有机酸或酶制剂合成相关蛋白的基因；进一步地，还包括将有机酸或酶制剂从发酵液中分离出来的步骤；
[0025]在一个具体实施方式中，所述宿主细胞是真菌，可选地，所述宿主细胞为黑曲霉(Aspergillus niger)，构巢曲霉(Aspergillus nidulans)，米曲霉(Aspergillus oryzae)，产黄青霉(Penicillium chrysogenum)，里氏木霉(Trichoderma reesei)，玉蜀黍黑粉菌(Ustilago mayd本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.具有强启动子活性的多核苷酸，其中，所述多核苷酸选自如下(a)
‑
(e)中组成的组中的任一项：(a)包括如SEQ ID NO：1
‑
5任一序列所示的核苷酸序列；(b)包括如SEQ ID NO：54
‑
60任一序列所示的核苷酸序列；(c)包含如SEQ ID NO：1
‑
5、54
‑
60任一序列所示的核苷酸序列的反向互补序列；(d)在高严格性杂交条件下，能够与(a)或(b)或(c)所示的核苷酸序列杂交的序列，并仍具有启动子活性；(e)与(a)或(b)或(c)所示的核苷酸序列具有至少90％，可选至少95％，优选至少97％，更优选至少98％，最优选至少99％的序列同一性，且仍具有启动子活性的序列。2.如权利要求1所述的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸的核苷酸序列如SEQ ID NO：1
‑
5、SEQ ID NO：54
‑
60任一序列所示。3.一种转录表达盒，其特征在于，包括权利要求1或2所述的多核苷酸，可选地，所述转录表达盒还包括所述具有启动子活性的多核苷酸可操作地连接的蛋白编码基因。4.一种重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体包括权利要求1或2所述的多核苷酸，或权利要求3所述的转录表达盒。5.一种重组宿主细胞，其特征在于，含有权利要求3所述的转录表达盒，或权利要求4的重组表达载体；优选地，所述宿主细胞是真菌，更优选地，所述宿主细胞为黑曲霉(Aspergillus niger)，构巢曲霉(Aspergillus nidulans)，米曲霉(Aspergillus oryzae)，产黄青霉(Penicillium chrysogenum)，里氏木霉(Trichoderma reesei)，玉蜀黍黑粉菌(Ustilago maydis)，嗜热毁丝霉(Myceli...

【专利技术属性】
技术研发人员：郑平，郑小梅，孙际宾，卢玉丹，周文娟，张立辉，马延和，
申请(专利权)人：中国科学院天津工业生物技术研究所，
类型：发明
国别省市：