基于LAMP-CRISPR/Cas12a可视化检测PCV2核酸的试剂盒及方法技术

一种基于LAMP

【技术实现步骤摘要】
基于LAMP
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CRISPR/Cas12a可视化检测PCV2核酸的试剂盒及方法


[0001]本专利技术属于生物
，涉及猪圆环病毒2型的检测，具体涉及一种将LAMP检测方法和CRPSPR
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Cas12检测方法相结合实现猪圆环病毒2型核酸的快速可视化检测试剂盒及方法。

技术介绍

[0002]猪圆环病毒2型(porcine circovirus type 2,PCV2)是导致断奶仔猪多系统衰竭综合征、猪呼吸疾病综合征、猪皮炎和肾病综合征等疾病的主要病原。PCV2感染可抑制生猪免疫系统，使得PCV2与其它病原混合感染，且混合感染引发的临床特征差异较大，导致PCV2临床诊断困难，继而给养猪业造成巨大的经济损失。快速、准确且及时的早期诊断对于PCV2的防控尤为重要，但传统的检测方法不仅需要昂贵的仪器设备，而且方法复杂，需要专业人士操作，还无法实现可视化检测，不利于病原现场诊断。因此，建立一种适合于现场诊断PCV2核酸的检测方法将有利于该病的防控。
[0003]规律成簇间隔的短回文重复序列(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR)是由一系列重复DNA序列及间隔序列组成，与CRISPR相关蛋白(CRISPR associatedprotein,Cas)组成CRISPR/Cas系统，其广泛存在于古细菌和许多细菌中，是原核生物应对外来核酸入侵的重要免疫机制。最近研究表明，CRISPR/Cas系统不但已广泛应用于基因编辑，且可作为核酸检测的新型方法，在病原检测方面具有较强的应用性。目前多种Cas蛋白可在sgRNA引导下有效切割靶基因序列，其中Cas12a蛋白也具有优异的靶基因序列特异性识别能力和高效的反式切割活性。因此，可利用Cas12a蛋白被靶向激活的特性，实现对靶标单链DNA的特异性检测。目前已有的核酸快速检测方法包括环介导等温扩增技术(LAMP)和重组酶聚合酶扩增法(RPA)等，此类方法需较昂贵的仪器或特殊等温仪器，且高速扩增过程中易造成假阳性。而CRISPR/Cas12a系统在此类恒温扩增方法的基础上加入了特异性切割检测，无疑在提高检测方法的灵敏性的同时又能避免假阳性。
[0004]因此，利用LAMP技术和CRISPR/Cas12a技术实现一种快速检测PCV2相关病的方法迫在眉睫。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的在于，针对上述现有技术的不足，提供一种基于LAMP
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CRISPR/Cas12a可视化检测猪圆环病毒2型的试剂盒及检测方法，以期能实现PCV2相关疾病的早期防控。
[0006]为达上述目的，本专利技术所采用的技术方案是：一种crRNA，其是用于检测猪圆环病毒2型核酸的crRNA，包括crRNA2
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F/R和crRNA3
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F/R，crRNA2
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F/R序列如SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所示，crRNA3
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F/R序列如SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12所示。
[0007]本专利技术又提供一种猪圆环病毒2型CRISPR/Cas12a检测体系，其包括LbCas12a蛋
白、上述crRNA和ssDNA探针，ssDNA序列如SEQ ID NO.13所示。
[0008]该CRISPR/Cas12a检测体系中，LbCas12a蛋白与crRNA的浓度比为1：1，ssDNA探针浓度为2μM。
[0009]本专利技术还提供一种可视化检测猪圆环病毒2型核酸的试剂盒，其包括前面提及的CRISPR/Cas12a检测体系。
[0010]进一步，本试剂盒还包括扩增所述核酸的引物，引物包括：F3/B3，如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示、FIP/BIP，如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示、LF/LB，如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示。
[0011]本专利技术同时提供一种可视化检测猪圆环病毒2型核酸的方法，该方法是利用前述的LAMP扩增引物扩增所述核酸，再将扩增产物加入到前述的CRISPR/Cas12a检测体系中检测所述核酸。
[0012]与现有技术相比，本专利技术的优点或有益效果为：本方法采用LAMP
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CRISPR/Cas12a检测体系，无需昂贵的热循环仪器，具有灵敏性高、特异性强的特点，且反应条件简单，可达到快速可视化检测目的。
附图说明
[0013]图1为LAMP检测体系的优化结果；其中，A：温度优化凝胶电泳图，M：DNA分子质量标准；1:阴性对照；2～8:分别对应58、60、62、63、64、65和66℃；B：时间优化凝胶电泳图，M：DNA分子质量标准，1：阴性对照；2～6:分别对应40、45、50、55和60min；C：Bst DNA酶量优化凝胶电泳结果，M：DNA分子质量标准；1～3:分别对应0.5、1.0和1.5μL，4：阴性对照；D：内外引物浓度比例优化凝胶电泳图，M：DNA分子质量标准；1～5:分别对应4：1、6：1、8：1、10：1和12:1；6：阴性对照。
[0014]图2为LAMP和普通PCR检测灵敏度的比较结果；其中，A：LAMP灵敏度检测结果；B：PCR灵敏度检测结果；C：可视化检测结果；M：DNA分子质量标准；1：阴性对照；2～8：分别为1
×
100～1
×
106copies/μL 10倍梯度稀释的重组质粒。
[0015]图3为LAMP特异性试验结果；其中，A：LAMP特异性检测结果；B：LAMP特异性检测可视化结果；M：DNA分子质量标准；1、2：猪圆环病毒2型；3：猪圆环病毒1型；4：猪圆环病毒3型；5：猪细小病毒；6：猪伪狂犬病病毒；7：猪繁殖与呼吸综合征病毒；8：猪流行性腹泻病毒；9：阴性对照。
[0016]图4为crRNA的筛选结果；其中，A：crRNA筛选可视化结果；B：荧光值数据柱状图。
[0017]图5为Cas12a蛋白与crRNA比例优化结果；其中，A：Cas12a蛋白与crRNA比例优化可视化结果；B：荧光值数据柱状图。
[0018]图6为ssDNA探针浓度优化结果；其中，A：ssDNA探针浓度优化可视化结果；B：荧光值数据柱状图。
[0019]图7为PCR
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CRISPR检测体系的灵敏度评估；其中，A：灵敏度分析可视化结果；B：荧光值数据柱状图。
[0020]图8为LAMP
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CRISPR检测体系的灵敏度评估；其中，A：灵敏度分析可视化结果；B：荧光值数据柱状图。
[0021]图9为LAMP
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CRISPR检测体系的特异性评估；其中，A：灵敏度分析可视化结果；B：荧
光值数据柱状图。
[0022]图10为30份DNA样品的LAMP
‑...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种crRNA，其特征在于，其是用于检测猪圆环病毒2型核酸的crRNA，包括crRNA2
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F/R和crRNA3
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F/R，crRNA2
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F/R序列如SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所示，crRNA3
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F/R序列如SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12所示。2.一种猪圆环病毒2型CRISPR/Cas12a检测体系，其特征在于，其包括LbCas12a蛋白、crRNA和ssDNA探针，crRNA序列如权利要求1所述，ssDNA序列如SEQ ID NO.13所示。3.如权利要求2所述的检测体系，其特征在于，所述LbCas12a蛋白与crRNA的浓度比为1：1。4.如权利要求2所述的检测体系，其特征在于，所述ssDNA探针浓度为2μM。5.一种可视化检测猪圆环病毒2型核酸的试剂盒，其特征在于，其包括权利要求2
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4中任一项所述的CRISPR/Cas12a检测体系。6.如权利要求5所述的试剂盒，其特征...

【专利技术属性】
技术研发人员：王爱兵，谭磊，廖帆，雷磊，段德勇，杨毅，湛洋，王乃东，雷红宇，邓治邦，王玉格，胡意，
申请(专利权)人：湖南农业大学，
类型：发明
国别省市：