【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及兽用生物制品领域，特别是涉及一种猪流行性腹泻病毒二价亚单位疫苗及制备方法。
技术介绍
1、猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus，pedv)属于冠状病毒科冠状病毒alphacoronavirus属，是猪流行性腹泻(porcine epidemic diarrhea，ped)的病原体。该疾病具有发病快、传染性强、死亡率高的特点，并以急性水样腹泻、呕吐和脱水为主要症状。1970年在欧洲首先发现pedv g1型。目前，变异pedv已成为导致仔猪腹泻和高病死率的主要病原体，给全球养猪业造成重大经济损失。
2、接种疫苗是目前防控ped的主要手段之一。目前市面上售卖的猪流行性腹泻疫苗主要都是传统的pedv灭活疫苗和弱毒疫苗。pedv灭活疫苗是通过加热或者化学试剂使pedv活病毒失活并配合佐剂使用的一种疫苗。灭活疫苗安全性更高且易于产业化。但是，在病毒灭活过程中，抗原的免疫原性可能会有一定损伤，灭活疫苗存在免疫持续期短、需要多次免疫等局限，通常需要多次免疫。与灭活疫苗相比，减毒疫苗免疫原性更强，通常单次免疫就可产生足够的免疫保护。但是，减毒疫苗最大的危害是存在退化为野生型毒株的风险，因此限制了减毒疫苗的适用性。
3、pedv orf2编码的纤突糖蛋白(spike,s)属于亚稳态的ⅰ类融合蛋白，主要负责病毒与宿主细胞的吸附和膜融合，包括受体结合片段s1和膜融合片段s2两个部分。s1包含优势抗原coe区域(499～638aa)及2个b淋巴细胞位点(744～755和75
4、真核表达系统是将载体转染至真核细胞中，对外源基因产物进行一系列复杂的加工折叠，形成具有生物活性的蛋白质。但其表达的周期相对较长，需要的条件也较为繁琐苛刻。其中，应用的最为广泛的就是酵母表达系统、昆虫表达系统以及哺乳动物细胞表达系统。其中哺乳动物细胞表达系统使重组基因易转染、遗传稳定、可重复，同时可以识别和去除内含子。哺乳动物细胞翻译后的加工修饰体系更趋完善，产生的外源蛋白质与天然的蛋白质更加相近，它的活性方面远胜于其他表达系统，免疫原性高，可改造成类人体源性，还可以分泌至培养基，纯化工艺操作简单。因此，本专利技术利用hek-293f细胞真核表达系统制备了针对不同亚型pedv s基因的一种二价亚单位疫苗，通过猪体动物实验评价了该疫苗的免疫效果，为ped亚单位疫苗的研发提供了理论支持。
技术实现思路
1、本专利技术的目的是提供一种猪流行性腹泻病毒二价亚单位疫苗及制备方法，以解决上述现有技术存在的问题，该二价亚单位疫苗在猪体具有免疫保护效果，为pedv亚单位疫苗的研发提供了基础。
2、为实现上述目的，本专利技术提供了如下方案：
3、本专利技术提供一种猪流行性腹泻病毒二价亚单位疫苗，包括重组蛋白pedv-2a-s和pedv-2b-s，其中，所述pedv-2a-s的氨基酸序列如seq id no：2所示，所述pedv-2b-s的氨基酸序列如seq id no：4所示。
4、优选的是，所述猪流行性腹泻病毒二价亚单位疫苗还包括佐剂。
5、优选的是，所述pedv-2a-s和pedv-2b-s的混合物与所述佐剂的体积比为1:1。
6、优选的是，所述混合物为所述pedv-2a-s和pedv-2b-s等质量混合，所述混合物在所述猪流行性腹泻病毒二价亚单位疫苗中的终浓度为0.3mg/ml。
7、优选的是，所述佐剂包括m103佐剂。
8、优选的是，所述pedv-2a-s的制备方法包括以下步骤：
9、将目的基因序列导入表达载体，构建重组表达载体；
10、将所述重组表达载体转入真核细胞表达，经蛋白纯化，获取所述pedv-2a-s；
11、其中，所述目的基因的核苷酸序列如seq id no：1所示。
12、优选的是，所述pedv-2b-s的制备方法包括以下步骤：
13、将目的基因序列导入表达载体，构建重组表达载体；
14、将所述重组表达载体转入真核细胞表达，经蛋白纯化，获取所述pedv-2b-s；
15、其中，所述目的基因的核苷酸序列如seq id no：3所示。
16、本专利技术还提供一种猪流行性腹泻病毒二价亚单位疫苗的制备方法，包括以下步骤：
17、将重组蛋白pedv-2a-s和pedv-2b-s混合后与佐剂等体积混合后，室温搅拌乳化，获取猪流行性腹泻病毒二价亚单位疫苗；其中，所述pedv-2a-s的氨基酸序列如seq id no：2所示，所述pedv-2b-s的氨基酸序列如seq id no：4所示。
18、优选的是，所述重组蛋白pedv-2a-s和pedv-2b-s按照等质量混合后，混合物在所述猪流行性腹泻病毒二价亚单位疫苗中的终浓度为0.3mg/ml。
19、本专利技术还提供重组蛋白pedv-2a-s和pedv-2b-s在制备猪流行性腹泻病毒二价亚单位疫苗中的应用，所述pedv-2a-s的氨基酸序列如seq id no：2所示，所述pedv-2b-s的氨基酸序列如seq id no：4所示。在制备猪流行性腹泻病毒二价亚单位疫苗中，包括但不限于重组蛋白pedv-2a-s和pedv-2b-s，还可以是pedv-2a-s和pedv-2b-s的编码基因，或包含pedv-2a-s和pedv-2b-s的编码基因的表达载体或者宿主细胞。
20、本专利技术公开了以下技术效果：
21、本专利技术通过实验证明重组真核质粒能特异性表达pedv g2a-s和g2b-s蛋白，且能够得到较纯的蛋白；通过将pedv g2a-s和g2b-s蛋白混合后与佐剂构建二价亚单位疫苗，用该疫苗免疫仔猪和母猪后，重组蛋白能有效刺激仔猪和母猪产生特异性抗体，且在血清和乳汁中诱导较高的中和抗体水平。相比于对照组，免疫组仔猪/乳猪肠道组织病变明显较少，只有一只或没有仔猪出现轻度腹泻；然而，在攻毒对照组中所有仔猪/乳猪均出现轻度至水样腹泻，且仔猪粪便中病毒载量明显升高，二价亚单位疫苗免疫组仔猪/乳猪的粪便中病毒载量较低。本专利技术明确了pedv g2a-s/g2b-s二价亚单位疫苗在猪体上的免疫保护效果，为pedv亚单位疫苗的研发提供了基础。
本文档来自技高网...【技术保护点】
1.一种猪流行性腹泻病毒二价亚单位疫苗，其特征在于，包括重组蛋白PEDV-2a-S和PEDV-2b-S，其中，所述PEDV-2a-S的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示，所述PEDV-2b-S的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示。
2.如权利要求1所述的猪流行性腹泻病毒二价亚单位疫苗，其特征在于，所述猪流行性腹泻病毒二价亚单位疫苗还包括佐剂。
3.如权利要求2所述的猪流行性腹泻病毒二价亚单位疫苗，其特征在于，所述PEDV-2a-S和PEDV-2b-S的混合物与所述佐剂的体积比为1:1。
4.如权利要求3所述的猪流行性腹泻病毒二价亚单位疫苗，其特征在于，所述混合物为所述PEDV-2a-S和PEDV-2b-S等质量混合，所述混合物在所述猪流行性腹泻病毒二价亚单位疫苗中的终浓度为0.3mg/mL。
5.如权利要求2所述的猪流行性腹泻病毒二价亚单位疫苗，其特征在于，所述佐剂包括M103佐剂。
6.如权利要求1所述的猪流行性腹泻病毒二价亚单位疫苗，其特征在于，所述PEDV-2a-S的制备方法包括以下步骤：
7.
8.一种猪流行性腹泻病毒二价亚单位疫苗的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
9.如权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述重组蛋白PEDV-2a-S和PEDV-2b-S按照等质量混合后，混合物在所述猪流行性腹泻病毒二价亚单位疫苗中的终浓度为0.3mg/mL。
10.重组蛋白PEDV-2a-S和PEDV-2b-S在制备猪流行性腹泻病毒二价亚单位疫苗中的应用，其特征在于，所述PEDV-2a-S的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示，所述PEDV-2b-S的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示。
...【技术特征摘要】
1.一种猪流行性腹泻病毒二价亚单位疫苗，其特征在于，包括重组蛋白pedv-2a-s和pedv-2b-s，其中，所述pedv-2a-s的氨基酸序列如seq id no：2所示，所述pedv-2b-s的氨基酸序列如seq id no：4所示。
2.如权利要求1所述的猪流行性腹泻病毒二价亚单位疫苗，其特征在于，所述猪流行性腹泻病毒二价亚单位疫苗还包括佐剂。
3.如权利要求2所述的猪流行性腹泻病毒二价亚单位疫苗，其特征在于，所述pedv-2a-s和pedv-2b-s的混合物与所述佐剂的体积比为1:1。
4.如权利要求3所述的猪流行性腹泻病毒二价亚单位疫苗，其特征在于，所述混合物为所述pedv-2a-s和pedv-2b-s等质量混合，所述混合物在所述猪流行性腹泻病毒二价亚单位疫苗中的终浓度为0.3mg/ml。
5.如权利要求2所述的猪流行性腹泻病毒二价亚单位疫苗，其特征在于...
【专利技术属性】
技术研发人员：李彬，范宝超，宋旭，郭容利，李运川，赵永祥，张雪寒，李基棕，孙敏，汪伟，朱雪蛟，胡米，
申请(专利权)人：江苏省农业科学院，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。