核酸适体-DNA甲基化酶调控miRNA嵌合体、制备方法及应用技术

本发明专利技术公开了一种核酸适体

【技术实现步骤摘要】
核酸适体
‑
DNA甲基化酶调控miRNA嵌合体、制备方法及应用


[0001]本专利技术涉及一种前列腺癌治疗药物和方法，属于生物医药应用领域，特别是涉及核酸适体
‑
DNA甲基化酶调控miRNA嵌合体、制备方法及应用。

技术介绍

[0002]前列腺癌是目前全球男性发病率第二高的恶性肿瘤，居男性癌症死因的第五位，我国前列腺癌发病率也呈明显上升趋势。研究估计，2015年我国新发男性前列腺癌病例约为7.2万，世界人口标化发病率为6.47/10万，中国人口标化发病率为6.59/10万；约有3.1万例死亡病例，世界人口标化死亡率为2.65/10万，中国人口标化死亡率为2.61/10万。在全国肿瘤登记地区中，前列腺癌位于目前中国男性泌尿生殖系统恶性肿瘤发病第一位，高于膀胱癌。
[0003]前列腺癌的发病机制较为复杂,目前认为遗传和表观遗传机制共同作用导致前列腺癌的发生、发展，其中表观遗传在前列腺癌的形成中起到重要的作用。采用雄激素阻断治疗(androgen ablation therapy，ADT)是当前公认的治疗手段。然而，在经过1.5至2年的雄激素阻断治疗有效期后，几乎所有的患者均进展为对去势不敏感前列腺癌阶段，即“去势抵抗性前列腺癌”。目前的医学研究进展对于激素抵抗性或者晚期前列腺癌还缺乏有效的治疗手段，因此进一步研究其发病机制尤其是表观遗传学非常必要。
[0004]DNA甲基化谱式的紊乱是肿瘤细胞基因组的重要特征之一。在肿瘤包括前列腺癌中基因组DNA整体水平低甲基化广泛存在。目前已经报道一些前列腺癌相关基因启动子区甲基化异常促使癌症发生，最常见的是抑癌基因启动子DNA高甲基化。癌症中DNA甲基化的异常被认为与DNA甲基化酶系统的异常表达有关，这个系统包括DNMT1，DNMT3A，DNMT3B和UHRF1等。DNMTs和UHRF1的高表达在大部分肿瘤中都普遍存在，并且与肿瘤的发生密切相关。然而，现在对于UHRF1以及其他DNMTs在肿瘤细胞中高表达的原因还不是非常清楚。
[0005]MicroRNA是一种含20
‑
22bp碱基的小非编码RNA。据估计，人类基因中的30％都是受到miRNA的调控。作为广泛的基因表达调控因子，microRNA能参与影响许多细胞生命活动，比如细胞周期，增殖，凋亡，分化和发育。miR
‑
145位于5号染色体，约覆盖4.09kb的区域，被发现在前列腺癌中低表达，影响细胞增殖、迁移和侵袭能力，表达受其自身启动子区甲基化调控。之前的研究发现miR
‑
145通过调控DNMT1、DNMT3B和UHRF1影响DNA甲基化修饰，进而能抑制前列腺癌、卵巢癌等多种肿瘤细胞增殖。因而miR
‑
145可作为前列腺癌一种潜在的有前途的新的治疗药物，但是目前面临的一个主要挑战是如何特异性将MicroRNA导入特定细胞，即靶向导入。
[0006]利用核酸适体(Aptamer，一种稳定的核酸靶向分子)实现靶向输送是目前正在发展的一个方法。Aptamer与靶蛋白结合的作用方式与抗体大致相同，且具有高结合性，易于制备，不引起免疫反应等优点。前列腺特异性膜抗原(Prostate
‑
Specific Membrane Antigen，PSMA)是前列腺癌细胞高表达的膜蛋白，为美国FDA批准的前列腺癌分子靶标。我们前期研发的前列腺特异性膜抗原定位(PSMA定位)的RNA核酸适体(PSMA Aptamer)，可特
异性结合前列腺特异性膜抗原(PSMA)，并能够向表达PSMA的前列腺癌(PCa)细胞和肿瘤靶向输送siRNA、药物、纳米颗粒和毒素。本专利技术将PSMA Aptamer与miRNA嵌合，证明PSMA适体能够靶向传递miRNA，从而进行选择性的作用于基因表达调控，为前列腺癌提供潜在的靶向治疗药物。

技术实现思路

[0007]本专利技术主要解决的技术问题是如何提供一种将前列腺特异性膜抗原定位(PSMA定位)的RNA核酸适体(PSMA Aptamer)与DNA甲基化酶调控miRNA进行嵌合的核酸适体
‑
DNA甲基化酶调控miRNA嵌合体。
[0008]为解决上述技术问题，本专利技术采用的一个技术方案是：提供核酸适体
‑
DNA甲基化酶调控miRNA嵌合体，所述核酸适体
‑
DNA甲基化酶调控miRNA嵌合体中包含有PSMA Aptamer(A10
‑
3)
‑
miR
‑
145的核苷酸序列，所述PSMA Aptamer(A10
‑
3)
‑
miR
‑
145的核苷酸序列用于靶向识别前列腺癌细胞，调控靶基因表达并改变DNA甲基化修饰。
[0009]在一个较佳实施例中，所述PSMA Aptamer(A10
‑
3)
‑
miR
‑
145的核苷酸序列为：
[0010]A10
‑
3(2
’‑
Fluoro
‑
pyrimidine,and deoxy
‑
T 3
’‑3’
cap modifications)
[0011]GGGAGGACGAUGCGGAUCAGCCAUGUUUACGUCACUCCUUGUCAAUCCUCAUCGGC
[0012]miR145(anti sense)
[0013]AGGGAUUCCUGGGAAAACUGGACUU
[0014]miR145(sense)
‑
link A10
‑3[0015]5′‑
GUCCAGUUUUCCCAGGAAUCCCUGCCGAUGAGGAUU
‑3′
。
[0016]一种核酸适体
‑
DNA甲基化酶调控miRNA嵌合体的制备方法，PSMA Aptamer(A10
‑
3)
‑
miR
‑
145嵌合体的制备步骤包括：
[0017]S1：将每个Aptamer及RNA oligo溶解在无菌的DEPC水中，使得终浓度为100u mol/L；
[0018]S2：将样本结合分组；
[0019]S3：将适体
‑
miRNAs混合物于95℃，5min短暂变性，然后放置在冰上冷却；
[0020]S4：退火的嵌合体在
‑
20℃下保存。
[0021]在一个较佳实施例中，将步骤S2中的样本进行分组，
[0022]组1：(A10
‑3‑
miR145)：A10
‑
3/miR145(sense)
‑
link A10
‑
3/miR145(anti sense)；
[0023]组本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种核酸适体
‑
DNA甲基化酶调控miRNA嵌合体，其特征在于，所述核酸适体
‑
DNA甲基化酶调控miRNA嵌合体中包含有PSMA Aptamer(A10
‑
3)
‑
miR
‑
145的核苷酸序列，所述PSMA Aptamer(A10
‑
3)
‑
miR
‑
145的核苷酸序列用于靶向识别前列腺癌细胞，调控靶基因表达并改变DNA甲基化修饰。2.根据权利要求1所述的核酸适体
‑
DNA甲基化酶调控miRNA嵌合体，其特征在于，所述PSMA Aptamer(A10
‑
3)
‑
miR
‑
145的核苷酸序列为：A10
‑
3(2
’‑
Fluoro
‑
pyrimidine,and deoxy
‑
T 3
’‑3’
cap modifications)GGGAGGACGAUGCGGAUCAGCCAUGUUUACGUCACUCCUUGUCAAUCCUCAUCGGCmiR145(anti sense)AGGGAUUCCUGGGAAAACUGGACUUmiR145(sense)
‑
link A10
‑
35
′‑
GUCCAGUUUUCCCAGGAAUCCCUGCCGAUGAGGAUU
‑3′
。3.一种核酸适体
‑
DNA甲基化酶调控miRNA嵌合体的制备方法，其特征在于，PSMA Aptamer(A10
‑
3)
‑
miR
‑
145嵌合体的制备步骤包括：S1：将每个Aptamer及RNA oligo溶解在无菌的DEPC水中，使得终浓度为10...

【专利技术属性】
技术研发人员：倪晓华，吴奇涵，张素芬，贺婉红，陈静，祝海军，
申请(专利权)人：上海市生物医药技术研究院，
类型：发明
国别省市：