表达用于感测可溶性抗原的适体嵌合抗原受体的免疫细胞制造技术

本发明专利技术提供了一种组合物，该组合物包含a)免疫细胞，该免疫细胞包含编码对适体具有特异性的适体CAR的多核苷酸，b)对可溶性抗原具有特异性的的适体，和c)可溶性抗原。在本发明专利技术的实施方式中，表达所述适体CAR的免疫细胞另外包含核酸，该核酸包含可操作地连接至编码效应物(如合成物)的核酸的诱导型启动子。物(如合成物)的核酸的诱导型启动子。物(如合成物)的核酸的诱导型启动子。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】表达用于感测可溶性抗原的适体嵌合抗原受体的免疫细胞


[0001]本专利技术总体上涉及在免疫细胞上表达的嵌合抗原受体(CAR)的领域，特别地涉及通过适体与可溶性抗原结合的适体CAR(抗标记CAR)。

技术介绍

[0002]嵌合抗原受体(CAR)T细胞疗法在治疗一系列血液学恶性肿瘤如急性淋巴细胞白血病方面已经显示出显著的成功。它基于遗传修饰T细胞以表达肿瘤特异性CAR受体，当肿瘤抗原被识别时，该受体在患者体内诱导T细胞激活、增殖和细胞溶解活性。CAR通过抗原识别部分，例如来源于抗体的单链可变片段(scFv)或Fab片段的抗原识别部分特异性地接合靶标。但是，CAR免疫疗法对实体瘤的应用相对有限，并且迄今表现出的成功也有限。通过CAR免疫疗法治疗实体瘤的这种有限的成功可能尤其是由免疫细胞固有特征如免疫(T)细胞耗竭，以及活跃的癌症免疫抑制机制、不利的肿瘤微环境(TME)、各种免疫抑制细胞的存在和缺乏合适的表面抗原引起的。
[0003]在WO 2019199689A1中，公开了包含单一病毒载体的工程化免疫细胞，所述单一病毒载体包含第一多核苷酸，所述第一多核苷酸包含与编码至少一种转基因(例如CAR)的核酸可操作地连接的组成型启动子；和第二多核苷酸，所述第二多核苷酸包含可操作地连接至编码效应物的核酸的诱导型启动子。这允许例如在结合对实体瘤表面上表达的肿瘤抗原具有特异性的CAR之后，在肿瘤微环境中原位表达效应物如IL
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6或另一炎性信号传导轴(signaling axis)。
[0004]Chang等人.(2018,Nat Chem Biol.14:317
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324)公开了CAR
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T细胞可以被工程化以强烈响应可溶性配体，条件是所述配体能够介导CAR二聚化。他们提出了一些对于由可溶性配体触发CAR可能重要的特征。首先，可溶性配体必须能够将两个或更多的CAR聚集在一起。第二，CAR
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配体结合亲和力必须足够强以承受CAR激活所需的张力。第三，所涉及的可溶性配体和CAR都必须具有足够的机械刚性以将张力传递至CAR的细胞内信号传导结构域。
[0005]通过适体间接结合靶细胞的“通用”CAR系统(或适体CAR(adCAR)系统)描述于例如WO 2012082841A2、WO 2013044225A1和WO 2016030414A1中。其中公开了适体，例如与靶细胞上表达的表面结合抗原结合的标记的抗体和免疫细胞表达的标记特异性CAR，其中标记可以是人工的(如FTTC)和潜在免疫原性的或可以与CAR结合的天然对应物竞争的内源分子。
[0006]本领域需要改进的或可替代的适体CAR系统。此外，本领域需要在临床环境中使用改进的或可替代的适体CAR系统，例如，在患有肿瘤的受试者中感测肿瘤微环境的可溶性抗原，并允许表达适体CAR的免疫细胞随后执行针对该肿瘤的细胞溶解活性。

技术实现思路

[0007]令人惊讶地发现，当适体CAR结合与可溶性抗原结合的适体时，表达与所述适体(其特异性结合可溶性抗原如可能存在于例如肿瘤微环境(TME)中的细胞因子)特异性结合
的所述适体CAR的免疫细胞可以被激活。激活表达适体CAR的免疫细胞的基本要求是可溶性抗原介导的适体CAR的二聚化。该发现是出乎意料的，因为与直接结合可溶性抗原的CAR相比，使用另外的非共价结合的间隔区分子(即适体)插入在抗原和免疫细胞表面上表达的CAR之间会使CAR系统转换为更不稳定的系统。尽管如此，出乎意料的是，当适体和可溶性抗原满足本文公开的标准时，该适体CAR系统机械刚性足以将张力传递至CAR的胞内信号传导结构域。
[0008]本专利技术提供了一种组合物，该组合物包含a)免疫细胞，该免疫细胞包含编码对适体具有特异性的适体CAR的多核苷酸，b)对可溶性抗原具有特异性的的适体，和c)可溶性抗原。在本专利技术的实施方式中，表达所述适体CAR的免疫细胞额外包含核酸，该核酸包含可操作地连接至编码效应物如合成转录因子、细胞因子或第二CAR的核酸的诱导型启动子。
附图说明
[0009]图1：用抗标记CAR T细胞感测可溶性抗原。
[0010]在细胞表面表达CAR的T细胞的示意图。CAR由胞内信号传导结构域、跨膜结构域和用于结合标记多肽的scFv组成。标记多肽介导可溶性抗原和CAR的结合并用作适体。适体分子和可溶性靶抗原在溶液中。适体分子与抗原的结合以及随后抗原/适体复合物与细胞表面上表达的CAR的结合导致细胞表面上的受体多聚化和细胞信号传导途径的激活。可溶性抗原可以仅在适体分子存在的情况下被CAR感测。可溶性抗原的结构特性定义了适体分子的抗原结合域的设置：
[0011]a)可溶性抗原提供抗原A和B，据此，标记多肽含有表位A和B的抗原结合结构域。
[0012]b)可溶性抗原提供抗原A和B，据此，第一标记多肽含有表位A的抗原结合结构域和第二标记多肽含有表位B的抗原结合结构域。
[0013]c)可溶性抗原提供两倍的表位E，据此，标记多肽含有表位E的抗原结合结构域。
[0014]图2：用于经由抗标记CAR T细胞感测可溶性因子的应用。
[0015]通常将CAR T细胞设计成响应于表面结合的抗原而不响应于TME中的可溶性抗原，这是将CAR T细胞疗法扩展到实体瘤的关键方面。
[0016]仅通过交换标记多肽，该系统允许用仅一种在T细胞表面上表达的抗标记CAR感测TME的多种可溶性因子。这意味着减少了制造时间和成本。此外，它允许在响应于肿瘤相关TME方面具有更大的灵活性。
[0017]该系统允许以局部、剂量依赖和时间控制的方式识别TME。由此，TME触发抗标记CAR T细胞的激活，这导致例如细胞因子的分泌。TME分子对T细胞的局部激活将增加安全性，因为CAR T细胞的激活限于肿瘤区域。
[0018]因此，抗标记CAR T细胞通过诱导局部炎症引发(prime)微环境，并且可以增强随后的针对肿瘤相关抗原或TME相关靶细胞的细胞毒性CAR T细胞应答。
[0019]图3：通过同二聚体可溶性LAP激活抗标记CAR T细胞需要至少一种标记的适体分子。
[0020]通过可溶性分子激活抗标记CAR T细胞需要在抗原和适体分子之间形成复合物。使用同二聚体重组人LAP，因此含有该表位结合位点的一个适体分子导致抗标记CAR T细胞激活。
[0021]用编码抗生物素CAR的LV颗粒转导三个健康独立供体的T细胞。转导的T细胞与125ng/mL重组人LAP(灰色条)或不与重组人LAP(白色条)共培养。将用生物素标记的两种不同的抗人LAP抗体克隆用作适体分子(克隆1：CH6
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17E5.1和克隆2：TW4
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2F8)。适体以1:1的比例使用，每个适体的浓度为10ng/mL，或者将适体单独使用。
[0022]24h后，通过流式细胞术分析LNGFR阳性细胞中CD69(a)和CD25(b)的均值。将值标准化为未使用用本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种组合物，该组合物包含：A)a)免疫细胞，该免疫细胞包含多核苷酸，该多核苷酸包含编码嵌合抗原受体(CAR)的核酸，该嵌合抗原受体包含i)对标记多肽的标记或对具有同一标记的两种标记多肽具有特异性的抗原结合结构域ii)跨膜结构域iii)胞内信号传导结构域b)所述标记多肽或所述两种标记多肽，其中所述标记多肽包含对可溶性抗原的表位A具有特异性的抗原结合结构域和对所述可溶性抗原的表位B具有特异性的抗原结合结构域，或者其中所述两种标记多肽中的第一种包含对所述可溶性抗原的表位A具有特异性的抗原结合结构域，并且所述两种标记多肽中的第二种包含对所述可溶性抗原的表位B具有特异性的抗原结合结构域，c)所述可溶性抗原，其中所述可溶性抗原包含所述表位A和所述表位B，或B)a)免疫细胞，该免疫细胞包含多核苷酸，该多核苷酸包含编码嵌合抗原受体(CAR)的核酸，该嵌合抗原受体包含i)对标记多肽的标记具有特异性的抗原结合结构域ii)跨膜结构域iii)胞内信号传导结构域b)所述标记多肽，其中所述标记多肽包含对可溶性抗原的表位E具有特异性的抗原结合结构域c)所述可溶性抗原，其中所述可溶性抗原包含至少两倍的所述表位E。2.如权利要求1所述的组合物，其中在B)的所述标记多肽中，对所述表位E具有特异性的所述抗原结合结构域存在至少两倍。3.如权利要求1或2所述的组合物，其中所述A)和/或B)的胞内信号传导结构域包含至少一个包含基于免疫受体酪氨酸的活化基序(ITAM)的初级胞质信号传导结构域。4.如权利要求1至3中任一项所述的组合物，其中所述A)的可溶性抗原和/或所述可溶性抗原B)是I)患有癌症的受试者的肿瘤微环境(TME)的可溶性抗原，和/或II)与患有自身免疫性疾病的受试者的所述自身免疫性疾病特异性相关的可溶性抗原，和/或III)与患有变态反应的受试者的所述变态反应疾病特异性相关的可溶性抗原，和/或IV)与患有感染的受试者的所述感染性疾病特异性相关的可溶性抗原，和/或V)与患有移植物排斥的受试者的所述移植物排斥特异性相关的可溶性抗原。5.如权利要求4所述的组合物，其中TME的所述可溶性抗原是精氨酸酶、癌胚抗原、CCL11、CCL18、CCL2、CCL5、CD282、循环肿瘤核酸、CXCL10、FAP、GM
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CSF、IFN
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γ、IL
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4、IL
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6、IL
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7IL
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8、IL
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10、IL
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11、IL
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12、Il
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13、IL
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14、IL
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15、IL
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17、IL
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23、IL
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33、IL
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1beta、IL
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IRa、INF、LAP、M
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CSF、MMP12、MMP13、MMP7、NY
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ESO
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1抗体、前列腺特异性抗原、sCD106、sCD137、sCD152、sCD223、sCD25、sCD27、sCD253 sCD270、sCD273、sCD274、sCD279、sCD28、sCD30、sCD366、sCD40、sCD54、sCD80、sCD86、sGFTR、TGFβ
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1、TGFβ
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2、TGFβ
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3、TIMP1、TNF
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α或VEGF，和/或其中与自身免疫性疾病特异性相关的所述可溶性抗原是CCL2、CCL3、CCL4、CCL5、CSCL11、CXCL10、CXCL8、CXCL9、GM
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CSF、IL
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1、IL10、IL
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11、IL
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12、IL
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15、IL
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17、IL
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18、IL
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2、IL
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21、IL
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22、IL
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23、IL
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6、IL
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7、IL
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8、INF或TNF，和/或其中与变态反应疾病特异性相关的所述可溶性抗原是变态反应原特异性IgE、嗜酸性粒细胞趋化因子、GM
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CSF、IFN、IL
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13、IL
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21、IL
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31、IL
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4、IL
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5、IL
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9、MCP
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1、MCP
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3、MCP
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4、MDC、sCD...

【专利技术属性】
技术研发人员：N，
申请(专利权)人：美天施生物科技有限两合公司，
类型：发明
国别省市：