从干细胞产生嵌合抗原受体修饰的T细胞以及其治疗用途制造技术

描述了用于制备表达嵌合抗原受体(CAR)的T细胞或NK细胞的方法。所述方法需要：分离T细胞群，从T细胞生成诱导多能干细胞(iPSC)，将编码CAR的核酸分子引入iPSC以产生CAR iPSC；并将CAR iPSC分化为CAR T细胞或CAR NK细胞。NK细胞。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】从干细胞产生嵌合抗原受体修饰的T细胞以及其治疗用途
[0001]优先权要求
[0002]本申请要求于2019年11月5日提交的美国临时申请序列号62/931,125的权益。前述全部内容通过引用并入本文。


[0003]本公开涉及从干细胞或祖细胞生成嵌合抗原受体修饰的T细胞和应用。

技术介绍

[0004]嵌合抗原受体(CAR)T细胞疗法是一种癌症治疗，它遗传改变T细胞以重新定向和利用它们的癌症杀伤潜力。目前FDA批准的CAR T细胞产品是基于自体的，需要个性化的血液单采血液成分术(apheresis)和制造。衍生患者特异性CAR T细胞产品昂贵、费力且耗时，并面临许多后勤和监管挑战。
[0005]从诱导多能干细胞(iPSC)生成CAR T细胞对于生成“现成的(off
‑
the
‑
shelf)”CAR T细胞产品和克服这些挑战具有令人鼓舞的前景。iPSC几乎可以无限增殖，同时保持其多能性和谱系分化潜力。然而，T细胞发育的复杂性和CAR表达对T细胞分化的干扰为成功的iPSC衍生的CAR T细胞生成带来了挑战。

技术实现思路

[0006]本文尤其描述了用于制备和使用来自多能干细胞胚胎干细胞(ESC)或诱导多能干细胞(iPSC)的表达嵌合抗原受体(CAR)的表型确定的、功能性的和/或可扩增的T细胞或NK细胞的方法。本文所述的CAR T细胞和CAR NK细胞靶向在靶细胞的细胞表面上表达的特异性预先确定抗原，具有增强的功能潜力，增强癌症和/或靶定的疾病的存活和治疗，和/或具有细胞毒性潜力和抗肿瘤活性。本文所述的CAR T细胞和CAR NK细胞可以用作“现成的”细胞以施用于多个接受者，其跨越免疫原性屏障并至少减轻移植物抗宿主病(GVHD)的症状。
[0007]在一些实施方案中，幼稚和记忆T(T
n/mem
)细胞衍生的iPSC是用于生成iPSC衍生的CAR T细胞的起始材料。在一些实施方案中，外周血单个核细胞(PBMC)、幼稚T(T
n
)细胞、记忆T(T
mem
)细胞、幼稚和记忆T细胞(T
n/mem
)或其组合衍生的iPSC是用于生成iPSC衍生的CAR T细胞的起始材料。不受理论束缚，T细胞已经具有在发育过程中重排的TCR基因，并且T衍生的iPSC维持重排的TCR基因座，这对于在体外分化过程中的T细胞发育很重要。在一些实施方案中并且不受理论约束，T
n/mem
是与终末分化的效应T细胞相比具有优质适应性的幼T细胞亚群。由于较少的表观遗传足迹，生成的T
n/mem
衍生的iPSC也可以具有独特的特性。
[0008]在一些实施方案中，本文描述了用于制备CAR T细胞组合物的方法，该方法包括：
[0009](a)分离外周血单个核细胞(PBMC)、幼稚T(Tn)细胞、记忆T(Tmem)细胞、幼稚和记忆T细胞(Tn/mem)或其组合的群体；
[0010](b)从PBMC、Tn细胞、Tmem细胞或Tn/mem细胞或其组合生成诱导多能干细胞(iPSC)；
[0011](c)使iPSC与编码CAR的载体接触，从而产生CAR iPSC；和
[0012](d)将CAR iPSC分化为CAR T细胞。
[0013]在一些实施方案中，本文描述了用于制备CAR NK细胞组合物的方法，该方法包括：
[0014](a)分离外周血单个核细胞(PBMC)、幼稚T(Tn)细胞、记忆T(Tmem)细胞、幼稚和记忆T细胞(Tn/mem)或其组合的群体；
[0015](b)从PBMC、Tn细胞、Tmem细胞或Tn/mem细胞或其组合生成诱导多能干细胞(iPSC)；
[0016](c)使iPSC与编码CAR的载体接触，从而产生CAR iPSC；和
[0017](d)将CAR iPSC分化为CAR NK细胞。
[0018]在一些实施方案中，PBMC、T
n
细胞、T
mem
细胞或T
n/mem
细胞或其组合是人的或分离自人血液。在一些实施方案中，PBMC、T
n
细胞、T
mem
细胞或T
n/mem
细胞或其组合是CD14
‑
、CD25
‑
和CD26L
+
。
[0019]在一些实施方案中，PBMC、T
n
细胞、T
mem
细胞或T
n/mem
细胞或其组合经重编程以生成iPSC。在一些实施方案中，通过使所述PBMC、T
n
细胞、T
mem
细胞或T
n/mem
细胞或其组合与OCT3/4、OCT3、OCT4、SOX2、KLF4、L
‑
MYC、C
‑
MYC、LIN28或靶向TP53的短发夹RNA(shRNA
‑
TP53)中的一种或多种接触而生成iPSC。在一些实施方案中，转导的细胞在补充有50U/mL IL
‑
2、0.5ng/ml IL
‑
15和CD3/CD28 Dynabeads(珠：细胞比率为1:1)的X
‑
Vivo15培养基中培养。在一些实施方案中，转染后第一、两天或三天，添加等体积的含有bFGF和10μM Y27632的PSC培养基。在一些实施方案中，第三天、四天、五天、六天或七天，然后将培养基完全更换为PSC培养基。在一些实施方案中，培养iPSC细胞至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、26、27、28、29或30天。在一些实施方案中，挑取单个集落以进一步培养和评估。
[0020]在一些实施方案中，使iPSC与编码CAR的核酸或载体接触而生成CAR iPSC。在一些实施方案中，转导的CAR iPSC在单细胞分选和iPSC定殖之前培养至少2代。在一些实施方案中，将定殖的CAR IPSC扩增并入库用于分化。
[0021]在一些实施方案中，IPSC或CAR iPSC是遗传修饰的。在一些实施方案中，一种或多种基因被敲除、下调或上调。在一些实施方案中，一种或多种基因包括TRAC、TRBC、B2M、CIITA或其组合中的一种或多种。在一些实施方案中，TRAC、TRBC、B2M、CIITA被敲除。在一些实施方案中，TRAC、TRBC、B2M、CIITA被下调。在一些实施方案中，遗传修饰通过本文所述的方法和本领域已知的方法来实现。在一些实施方案中，遗传修饰方法包括基因编辑、同源重组、非同源重组、RNA介导的遗传修饰、DNA介导的遗传修饰、锌指核酸酶、大范围核酸酶、TALEN或CRISPR/CAS9。
[0022]在一些实施方案中，CAR iPSC分化成胚胎中胚层祖(EMP本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.用于制备表达嵌合抗原受体(CAR)的T细胞或NK细胞的组合物的方法，所述方法包括：(a)分离外周血单个核细胞(PBMC)、幼稚T(T
n
)细胞、记忆T(T
mem
)细胞、幼稚和记忆T细胞(T
n/mem
)或其组合的群体；(b)从所述PBMC、T
n
细胞、T
mem
细胞或T
n/mem
细胞或其组合生成诱导多能干细胞(iPSC)；(c)使所述iPSC与编码所述CAR的载体接触，从而产生CAR iPSC；和(d)将所述CAR iPSC分化为CAR T细胞或CAR NK细胞。2.权利要求1所述的方法，其中所述PBMC、T
n
细胞、T
mem
细胞或T
n/mem
细胞或其组合是人的或分离自人血液。3.权利要求1所述的方法，其中所述PBMC细胞是CD14
‑
、CD25
‑
和CD26L
+
。4.权利要求1所述的方法，其中通过使所述PBMC、T
n
细胞、T
mem
细胞或T
n/mem
细胞或其组合与OCT3/4、OCT3、OCT4、SOX2、KLF4、L
‑
MYC、C
‑
MYC、LIN28或靶向TP53的短发夹RNA(shRNA
‑
TP53)中的一种或多种接触而生成所述iPSC。5.权利要求1所述的方法，其中所述iPSC是遗传修饰的。6.权利要求5所述的方法，其中所述遗传修饰包括敲除一种或多种基因，其中所述一种或多种基因包括TRAC、TRBC、B2M、CIITA或其组合中的一种或多种。7.权利要求5所述的方法，其中所述遗传修饰方法包括基因编辑、同源重组、非同源重组、RNA介导的遗传修饰、DNA介导的遗传修饰、锌指核酸酶、大范围核酸酶、TALEN或CRISPR/CAS9。8.权利要求1所述的方法，其中将所述CAR iPSC分化为CAR T细胞或CAR NK细胞的步骤包括将所述表达CAR的iPSC分化为胚胎中胚层祖(EMP)细胞和将所述EMP分化为CAR T细胞。9.权利要求8所述的方法，其中所述EMP细胞是CD56
+
和CD326
‑
。10.权利要求1所述的方法，其中将所述CAR iPSC分化成CAR T细胞或CAR NK细胞的步骤包括将所述表达CAR的iPSC分化成胚胎中胚层祖(EMP)细胞和将所述EMP分化成CAR NK细胞。11.权利要求10所述的方法，其中所述EMP细胞是CD56
+
和CD326
‑
。12.权利要求1所述的方法，其中将所述CAR iPSC分化为CAR T细胞或CAR NK细胞的步骤包括将所述CAR iPSC分化为CD34
+
造血干细胞和祖细胞(HSPC)以及将所述HSPC分化为CAR T细胞。13.权利要求1所述的方法，其中将所述CAR iPSC分化为CAR T细胞或CAR NK细胞的步骤包括将所述CAR iPSC分化为CD34+HSPC和将所述HSPC分化为CAR NK细胞。14.权利要求1所述的方法，其中将所述CAR iPSC分化成CAR T细胞的步骤包括使用基于纳米纤维基质的培养系统。15.权利要求1所述的方法，其中将所述CAR iPSC分化成CA...

【专利技术属性】
技术研发人员：SJ福曼，CE布朗，Z王，
申请(专利权)人：希望之城公司，
类型：发明
国别省市：