高表达高比活蛋白酶K突变体序列、毕赤酵母表达质粒的构建及菌株筛选和纯化方法技术

本发明专利技术公开了蛋白酶K（Proteinase K）突变体的序列及其分泌表达的酵母菌株Proteinase K

【技术实现步骤摘要】
高表达高比活蛋白酶K突变体序列、毕赤酵母表达质粒的构建及菌株筛选和纯化方法


[0001]本专利技术涉及酶基因功能改造
，具体涉及高表达高比活蛋白酶K（Proteinase K） 序列的确认、该序列毕赤酵母表达载体的构建、分泌表达蛋白酶K的毕赤酵母菌株Proteinase K
ꢀ‑
m/ pGAPZα
‑
A/GS115构建、构建结果及利用它来生产高表达高活性蛋白酶K的纯化方法。

技术介绍

[0002]蛋白酶K( Proteinase K) 是从白色念珠菌林伯氏白色念球菌（tritirachium album limber）分离出来的强力蛋白溶解酶，是一种切割活性较广的丝氨酸蛋白酶。它切割脂族氨基酸和芳香族氨基酸的羧基端肽键。由于蛋白酶K在尿素和SDS中稳定，还具有降解天然蛋白质的能力，因而它应用很广泛，包括制备脉冲电泳的染色体DNA，蛋白质印迹以及去除DNA和RNA制备中的核酸酶。蛋白酶K已广泛应用在皮革、毛皮、丝绸、医药、食品、酿造等方面。皮革工业的脱毛和软化已大量利用蛋白酶，既节省时间，又改善劳动卫生条件。蛋白酶还可用于蚕丝脱胶、肉类嫩化、酒类澄清。临床上可作药用，如用胃蛋白酶治疗消化不良，用酸性蛋白酶治疗支气管炎，用弹性蛋白酶治疗脉管炎以及用胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶对外科化脓性创口的净化及胸腔间浆膜粘连的治疗。加酶洗衣粉是洗涤剂中的新产品，含碱性蛋白酶，能去除衣物上的血渍和蛋白污物。而来自自然界微生物产生的蛋白酶K，由于菌体内含量低，活性低，提取工艺复杂，生产成本高，市场价格居高不下，阻碍了蛋白酶K的推广使用。

技术实现思路

[0003]为解决上述技术问题，本专利技术提供一种高表达高比活蛋白酶K突变体序列、毕赤酵母表达质粒的构建及菌株筛选和纯化方法。
[0004]本专利技术提供如下技术方案：我们选择重组表达的蛋白酶K是白色念珠菌林伯氏白色念球菌（tritirachium album limber）分离出来的强力蛋白溶解酶，是一种切割活性较广的丝氨酸蛋白酶，成熟的蛋白酶K含有384个氨基酸，分子量为40299道尔顿，pH值为6.68。根据对蛋白酶K分子结构及序列的分析，我们设计将第66位的缬氨酸（Val）突变为丝氨酸(Ser）,以提高蛋白酶K的比活性并增加蛋白酶K在毕赤酵母表达系统的表达量。
[0005]一种蛋白酶K突变体，蛋白酶K突变体的氨基酸序列为SEQ ID NO.1所示。
[0006]该序列的特点是将第66位的缬氨酸（Val）突变为丝氨酸(Ser）,以提高蛋白酶K的比活性。同时，本专利技术采用毕赤酵母分泌表达系统，该系统产量高、生产成本低兼有真核表达系统翻译后修饰功能等优点，可以用于大量生产蛋白酶K，降低生产成本。
[0007]蛋白酶K毕赤酵母重组菌株的构建方法为：将修饰突变的蛋白酶KProteinase K基因插入pGAPZα
‑
A空载体的GAP启动子/α
‑
factor信号肽下游位点，并删除载体上的Kex2位点
Lys
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Arg之后的Ste13位点Glu
‑
Ala
‑
Glu
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Ala,构建成蛋白酶K基因分泌型表达载体Proteinase K
‑
m/ pGAPZα
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A；利用电转化的方法将Proteinase K
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m/ pGAPZα
‑
A载体转化毕赤酵母（Pichia pastoris）的菌株GS115，构建成分泌型表达蛋白酶K突变体的毕赤酵母工程菌株Proteinase K
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m/ pGAPZα
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A/GS115；通过抗生素筛选、SDS
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PAGE电泳分析及生物比活性测定，获得高表达高活性的蛋白酶K突变体毕赤酵母重组菌株。
[0008]上述的毕赤酵母重组菌株目标蛋白：蛋白酶K突变体（Proteinase K
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m）的表达量达到366.7毫克/升，比活性为26.8国际单位/毫克；目标蛋白蛋白酶K突变体比天然的蛋白酶K比活性高7
‑
8倍，且具有很高的稳定性。
[0009]蛋白酶K突变体的纯化方法为：利用获得高活性的蛋白酶K突变体毕赤酵母重组菌株进行发酵，离心收集上清液，以氢氧化钠调节pH值，过阴离子交换层析柱，收集目标洗脱峰，得到纯度约70%的蛋白酶K突变体粗品，透析除盐，超滤浓缩，过分子筛层析柱，收集目标蛋白，得到纯度大于95%的蛋白酶K突变体蛋白。
[0010]与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：本专利技术采用基因工程表达的方法生产高活性的蛋白酶K突变体，比活性达到26.8国际单位/毫克，表达量达到366.7毫克/升蛋白，通过纯化可获得纯度达95%以上的目标蛋白蛋白酶K，为蛋白酶K今后的推广使用奠定良好基础。
附图说明
[0011]图1为蛋白酶K突变体（Proteinase K
‑
m）表达载体构建图。
[0012]Proteinase K
‑
m/ pGAPZα
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A表达载体分子大小为4.299kb。其中pGAPZα
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A为3.147kb，Proteinase K
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m为1152bp(包含终止子密码)；Proteinase K
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m插入于载体pGAPZα
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A第747与824bp（XbaI位点）之间。
[0013]pGAPZα
‑
A载体结构为：磷酸甘油酸脱氢酶基因（GAP）启动子区域：第1
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483bp,磷酸甘油酸脱氢酶基因启动子引物位点：第455
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476bp,α
‑
交配因子分泌信号肽序列：第493
‑
759bp,α
‑
交配因子分泌信号肽引物位点：第696
‑
716bp,载体多克隆位点：第760
‑
828bp,Myc抗原决定簇包：第827
‑
856bp,3
’‑
乙醇氧化酶1基因引物位点：第974
‑
994bp,乙醇氧化酶1转录终止区域：第593
‑
1233bp,转录延伸因子1启动子区域：第1234
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1644bp,合成原核启动子：第1645
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1712bp,链霉菌zeocin抗性基因阅读框：第1713
‑
2087bp,细胞色素合成酶1转录终止区域：第2088
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2405bp,大肠杆菌复制子1（来源于pUC载体）：第2416
‑
3089bp。
具体实施方式
[0014]下面将结合本专利技术实施例中的附图，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完
整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种蛋白酶K突变体序列，其特征在于：蛋白酶K突变体的氨基酸序列为SEQ ID NO.1所示。2.一种蛋白酶K突变体表达载体，其特征在于：表达质粒中转入了权利要求1所述的蛋白酶K突变体基因。3.根据权利要求2所述的一种蛋白酶K突变体表达载体，其特征在于：表达质粒pGAPZα
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A。4.一种蛋白酶K突变体表达载体的构建，其特征在于：将修饰突变的蛋白酶K Proteinase K基因插入pGAPZα
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A空载体的GAP启动子/α
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factor信号肽下游位点，并删除载体上的Kex2位点Lys
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Arg之后的Ste13位点Glu
‑
Ala
‑
Glu
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Ala，构建成蛋白酶K基因分泌型表达载体Proteinase K<...

【专利技术属性】
技术研发人员：王宇丰，殷三福，万山青，
申请(专利权)人：河南合智医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：