包含牛肠激酶轻链蛋白的融合蛋白及其表达载体和重组工程菌制造技术

本发明专利技术涉及基因工程技术领域，具体涉及一种包含牛肠激酶轻链蛋白的融合蛋白，及其表达载体和重组大肠杆菌工程菌。本发明专利技术通过对肠激酶酶切位点多肽、连接体多肽和伴侣蛋白的选择，提高了融合蛋白的表达量和表达稳定性。本发明专利技术的牛肠激酶轻链蛋白重组工程菌能够显著提高牛肠激酶轻链蛋白的表达量和活性收率。提高牛肠激酶轻链蛋白的表达量和活性收率。

【技术实现步骤摘要】
包含牛肠激酶轻链蛋白的融合蛋白及其表达载体和重组工程菌


[0001]本专利技术涉及基因工程
，具体涉及一种包含牛肠激酶轻链蛋白的融合蛋白及其表达载体和重组大肠杆菌工程菌。

技术介绍

[0002]丝氨酸蛋白酶肠激酶（enterokinase）（简称肠激酶或EK酶），也被称为肠肽酶（enteropeptidase），是异源二聚体丝氨酸蛋白酶，一种催化胰蛋白酶原转变为活性胰蛋白酶的哺乳动物酶。肠激酶优先选择底物序列Asp
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Asp
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Asp
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Asp
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Lys（DDDDK），并选择性地在赖氨酸之后切割。由于肠激酶的轻链结构在人、牛和猪中保守，其识底物别序列Asp
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Asp
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Asp
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Asp
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Lys在脊椎动物中也有很强的保守性，且几乎所有被定序的胰蛋白酶原都具有作用于4个天冬酰胺相连识别序列的特征，而此序列在其他的天然蛋白质上又非常罕见。肠激酶由1条结构亚基（重链）和1条催化亚基（轻链）构成，两者通过1个分子间二硫键结合，结构亚基负责将催化亚基固定在小肠刷状缘膜上并引导它向肠腔移动，催化亚基可以特异性识别Asp
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Asp
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Asp
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Asp
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Lys序列并沿序列的羧基端切下，将胰蛋白酶原活化为胰蛋白酶，从而启动各种酶原活化的级联。
[0003]在大肠杆菌（E.coli）中，许多哺乳动物蛋白被表达为融合蛋白，其必须被切割以释放成熟的活性蛋白。为了实现该目的，就需要有使用工具酶，优选直接在连接处切割而在产物上不留下额外氨基酸的工具酶。由于肠激酶的底物酶切位点序列具有上述高度的特异性，使得其成为基因工程融合蛋白表达后修饰过程中一个极其有用的工具酶而被广泛应用。
[0004]目前，重组基因工程菌表达是制备重组工具酶的主要方法，表达系统包括原核基因表达系统、真核基因表达系统和动物细胞表达系统。而在工具酶制备中，前两者是最为常用的表达系统。对于原核基因表达系统，使用最多的即为大肠杆菌Escherichiacoli来作为宿主菌，这也是目前应用最广泛的蛋白表达系统。原因是大肠杆菌表达系统遗传背景和生理特性研究清楚，已开发有多种商业化工程菌可以使用；且大肠杆菌易于培养和控制、转化操作简单，并具有表达水平高、成本低、周期短等特点。对于应用原核系统表达外源基因时，大多研究利用融合蛋白表达方式，将各种不同的引导肽序列融合到目的基因上，形成重组融合蛋白。在大肠杆菌中表达时，引导肽可以将目的蛋白分泌到细胞周质甚至细胞外，最后，通过蛋白酶等将引导肽切除去。
[0005]但由于肠激酶自身氨基酸序列和结构特点，对于目前广泛应用的大肠杆菌表达系统获得的其包涵体存在着蛋白表达量低、包涵体产物复性困难等的问题。因此，仍需要能够更优的适应大肠杆菌表达系统，具备更高的分泌表达和活性收率的重组肠激酶。

技术实现思路

[0006]为了解决上述技术问题，本专利技术提供了一种包含牛肠激酶轻链蛋白的融合蛋白，
ID No:6所示的连接体多肽，伴侣蛋白进一步优选SEQ ID No:8或SEQID No:11所示的伴侣蛋白。
[0010]作为本专利技术一种优选的技术方案，在上述牛肠激酶轻链蛋白的重组融合蛋白中，连接体多肽选自如SEQ ID No:4氨基酸序列所示的连接体多肽，伴侣蛋白选自如SEQ ID No:8所示的氨基酸序列；或者连接体多肽选自如SEQ ID No:6氨基酸序列所示的连接体多肽，伴侣蛋白选自如SEQ ID No:11所示的氨基酸序列。经筛选实验发现，SEQ ID No:4所示氨基酸序列的连接体多肽与SEQ ID No:8所示的伴侣蛋白合用的组合方式，SEQ ID No:6所示氨基酸序列的连接体多肽与SEQ ID No:11所示的伴侣蛋白合用的组合方式，可更有效的促进目的蛋白的表达。
[0011]作为本专利技术一种优选的技术方案，在牛肠激酶轻链蛋白的重组融合蛋白中，SEQ ID No:4氨基酸序列所示的连接体多肽与SEQ ID No:8所示的伴侣蛋白合用时，活性的目的蛋白的表达量更高。如SEQ ID No:8氨基酸序列所示的TrxA伴侣蛋白，可帮助目的蛋白高效表达，同时也可促进二硫键的正确形成，帮助目的蛋白正确折叠，从而进一步提高牛肠激酶轻链蛋白的稳定性。
[0012]在本专利技术中，牛肠激酶轻链可以为野生型，其氨基酸序列如SEQ ID No:1所示。作为优选的技术方案，所述牛肠激酶轻链可以为牛肠激酶轻链突变体；其氨基酸序列如SEQ ID No:12或SEQ ID NO:13所示。
[0013]牛肠激酶轻链突变体的设计方式为：在野生型牛肠激酶轻链基础上，在101、112、177位氨基酸发生突变，具体的突变为：K101P、C112T和A177K。上述突变体可改善蛋白的体外复性效率，提高蛋白本身的溶解性，保持蛋白酶的特异性和活性，进而能够提高收率，实现产业化应用价值的有效提升。
[0014]野生型牛肠激酶轻链（即EK酶）在变复性过程中稳定性差、复性率低、不利于纯化。而EK
L
m1是一种已商业化EK酶（雅心），其相对于衍生型牛肠激酶轻链第112位半胱氨酸突变为苏氨酸，该突变使得EK
L
m1相较于野生型具备更好的复性率，该EK酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:12所示。
[0015]虽然上述EK
L
m1相较于野生型具备更优的复性率，但碍于EK酶特点，其复性收率仍相对较低。为了获得改善的蛋白的体外复性效率，提高蛋白本申的溶解性，保持蛋白酶的特异性和活性，进而能够提高收率，实现产业化应用价值的有效提升，专利技术人设计了牛肠激酶轻链突变体。本专利技术结合序列的保守型及三维空间结构分析，在野生型牛肠激酶轻链氨基酸序列的第101位引入脯氨酸残基，可以减少变性过程中聚集体的产生。在突变体EKLm1的氨基酸序列基础上将第101位赖氨酸突变为脯氨酸、第177位氨基酸突变为赖氨酸，得到突变体EKLm3，其氨基酸序列如SEQ ID No:13所示。
[0016]具体的突变体EK酶的氨基酸序列如下：(1) 突变体EK
L
m1氨基酸序列SEQ ID No:12：IVGGSDSREGAWPWVVALYFDDQQVCGASLVSRDWLVSAAHCVYGRNMEPSKWKAVLGLHMASNLTSPQIETRLIDQIVINPHYNKRRKNNDIAMMHLEMKVNYTDYIQPITLPEENQVFPPGRICSIAGWGALIYQGSTADVLQEADVPLLSNEKCQQQMPEYNITENMVCAGYEAGGVDSCQGDSGGPLMCQENNRWLLAGVTSFGYQCALPNRPGVYARVPRFTEWIQSFLH；（2）突变体EK
L
m3氨基酸序列SEQ ID No:13：
IVGGSDSREGAWPWVVALYFDDQQV本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种包含牛肠激酶轻链蛋白的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白由牛肠激酶轻链蛋白的N端依次连接肠激酶酶切位点多肽、连接体多肽和伴侣蛋白而成；其中，（1）所述肠激酶酶切位点多肽的氨基酸序列如SEQ ID No:2所示；（2）所述连接体多肽氨基酸序列如SEQ ID No:4或SEQ ID No:6所示，所述伴侣蛋白氨基酸序列如SEQ ID No:8或SEQ ID No:11所示。2.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述连接体多肽氨基酸序列如SEQ ID No:4所示，所述伴侣蛋白氨基酸序列如SEQ ID No:8所示；或所述连接体多肽氨基酸序列如SEQ ID No:6所示，所述伴侣蛋白氨基酸序列如SEQ ID No:11所示。3.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述牛肠激酶轻链蛋白选自氨基酸序列如SEQ ID No:1、SEQ ID No:12或SEQ ID No:13所示的牛肠激酶轻链蛋白。4.一种用于编码权利要求1~ 3任一项所述融合蛋白的多核苷酸。5.根据权利要求4所述的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸的序列如SEQ ID No:14或SEQ ID No:15...

【专利技术属性】
技术研发人员：曹海燕，林兆生，连婕妮，王惠，刘伟华，徐艳玲，
申请(专利权)人：吉林惠升生物制药有限公司，
类型：发明
国别省市：