一种批发酵提升鸭疫里默氏菌明胶液化酶产量的方法技术

本发明专利技术属于微生物发酵培养技术领域，公开了一种批发酵提升鸭疫里默氏菌RA1明胶液化酶产量的方法，对血清1型鸭疫里默氏菌进行批发酵法发酵培养，得到发酵液；对发酵液进行离心、沉淀、透析，将回收目标产物采用PBS缓冲液反复冲洗作为明胶酶纯品，明胶酶纯品经明胶液化酶液化实验证明呈阳性，即得明胶液化酶终产物；采用SDS

【技术实现步骤摘要】
一种批发酵提升鸭疫里默氏菌明胶液化酶产量的方法


[0001]本专利技术属于微生物发酵培养
，尤其涉及一种批发酵提升鸭疫里默氏菌明胶液化酶产量的方法。

技术介绍

[0002]目前，鸭疫里默氏菌(Rimerella
‑
anatipestifer，RA)是鸭传染性浆膜炎病的病原体，它侵入机体可引起以纤维素性多发性浆膜炎、脑膜炎为特征的全身性疾病。鸭疫里默氏菌是一种非溶血性，非运动性、革兰氏阴性细小杆菌。随着世界养鸭业的发展，该病已成为全球范围内影响养鸭业的一种重要细菌性疾病。研究发现，RA(血清1型，RA1)能分泌一种液化明胶的蛋白酶(明胶液化酶)，是其致病的重要原因。当前实验室获得该酶主要采用三角烧瓶培养，获得的产量非常有限，因此采用自动化大罐培养显得十分重要。
[0003]通过上述分析，现有技术存在的问题及缺陷为：
[0004](1)采用三角烧瓶小批量培养产量非常低；
[0005](2)不能自动监测发酵过程。
[0006]解决以上问题及缺陷的难度为：研究微生物放大培养的生长适应性，通过优化发酵条件和调整参数，找出放大培养获得高产RA1明胶液化酶方法。
[0007]解决以上问题及缺陷的意义为：通过工业化发酵罐可以实时监测发酵过程动态变化，获得RA1分泌明胶液化酶的最佳条件，为后续研究其致病机理提供明胶液化酶样品。

技术实现思路

[0008]针对现有技术存在的问题，本专利技术提供了一种批发酵提升鸭疫里默氏菌明胶液化酶产量的方法。
[0009]本专利技术是这样实现的，一种批发酵提升鸭疫里默氏菌明胶液化酶产量的方法包括：
[0010]步骤一，对血清1型鸭疫里默氏菌进行批发酵法发酵培养，得到发酵液；
[0011]步骤二，明胶酶纯化与制备：对发酵液进行离心、沉淀、透析，将得到的回收目标产物采用PBS缓冲液反复冲洗作为明胶酶纯品；
[0012]步骤三，采用SDS
‑
PAGE方法对明胶液化酶终产物进行分子量测定。
[0013]进一步，所述步骤一，具体包括：
[0014]菌种复苏：冰箱
‑
70℃保存的血清1型鸭疫里默氏菌(RA1)融化后，无菌操作法用接种环取菌泥涂布新鲜制备的巧克力平板，并划线接种后，置培养箱37℃含有5％CO2条件下孵育16
‑
24小时，直至生长出圆润隆起透明的单个菌落，保证菌落的纯净；
[0015]RA1扩大培养：取RA1单个菌落涂布巧克力平板，在平板上长出大量菌丛后，转入1000毫升三角烧瓶的液体培养基过夜培养，调整菌液的OD
600
＝0.6作为发酵种子储备液。该发酵种子液储备液菌体在显微镜下(1000倍油镜)检查菌体饱满，无明显异型性和杂菌；经过血清学检查呈抗体阳性。发酵种子储备液经发酵液放大培养作为发酵种子液；
[0016]批发酵法培养RA1：在发酵罐中灌注3.5升发酵培养基，待培养基完全溶解后加入RA1复壮发酵种子液，调整发酵罐参数，发酵24小时后测定发酵液的pH值，对发酵终点进行判断。
[0017]进一步，所述过夜培养包括：转入装有发酵液体培养基的100毫升三角烧瓶过夜培养，调整菌液的OD
600
＝0.6作为发酵种子液。
[0018]进一步，所述培养基完全溶解后调整温度至37.0℃，无菌操作加入1.0％的RA1复壮发酵种子液。
[0019]进一步，所述调整发酵罐参数，包括：
[0020]温度参数：维持37.0℃；
[0021]溶氧参数：0
‑
4小时溶氧30％，5
‑
12小时20％，13
‑
24小时10％；
[0022]搅拌速度参数：0
‑
4小时400rpm，5
‑
12小时200rpm，13
‑
24小时100rpm；
[0023]pH参数：0
‑
4小时7.35，5
‑
12小时7.0，13
‑
24小时6.8；
[0024]消泡剂用量：0.1％聚氧乙烯氧丙烯甘油；
[0025]补糖参数：12
‑
24小时之间补充0.1％葡萄糖。
[0026]进一步，步骤二中，所述明胶酶纯化与制备，具体包括：
[0027](1)发酵液采用冷冻离心机离心，丢弃沉淀，回收离心液；
[0028](2)在离心液添加硫酸铵至终浓度60％，静置6小时，12000rmp离心20分钟分离沉淀；
[0029](3)将沉淀置缓冲液中透析过夜，得到的透析液用DEAE
‑
SepharoseFastFlow，苯基琼脂糖凝胶(phenyl
‑
SepharoseCL
‑
4B)层析与Superdex75柱层析；
[0030](4)回收目标产物采用PBS缓冲液反复冲洗作为明胶酶纯品，明胶酶纯品经明胶液化酶液化实验证明呈阳性，即得明胶液化酶终产物。
[0031]进一步，步骤(1)中，所述离心机以6000rmp，在4℃条件下离心15min。
[0032]进一步，步骤(3)中，所述缓冲液采用pH7.5，0.01M的Tris
‑
HCl。
[0033]进一步，所述发酵培养基的制备方法包括：
[0034]胰化蛋白胨10.0g,酵母提取物5.0g，NaCL10.0g，维生素B250毫克，维生素B6100毫克，维生素B
12
20毫克用1.0NNaOH调节pH值至7.2，用去离子水定容至1.0L，121℃15分钟高压蒸气灭菌备用。
[0035]进一步，所述血平板的制备方法包括：
[0036]胰化蛋白胨10.0g,酵母提取物5.0g，NaCL10.0g，用1.0NNaOH调节pH值至7.2，用去离子水定容至1.0L，121℃15分钟高压蒸气灭菌，冷却到45℃按照每500毫升/5毫升剂量加入新鲜兔血，凝固后备用。
[0037]结合上述的所有技术方案，本专利技术所具备的优点及积极效果为：
[0038](1)与常规实验室1.0升三角烧瓶发酵相比，批发酵可以获得3.5升发酵液；
[0039](2)与常规制备含量0.22克/升相比，本方法分离获得的RA1明胶液化酶含量达到0.68克/升。
附图说明
[0040]为了更清楚地说明本申请实施例的技术方案，下面将对本申请实施例中所需要使
用的附图做简单的介绍，显而易见地，下面所描述的附图仅仅是本申请的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0041]图1是本专利技术实施例提供的批发酵提升鸭疫里默氏菌明胶液化酶产量的方法流程图。
[0042]图2是本专利技术实施例提供的批发酵提升鸭疫里默氏菌明胶液化酶产量的方法的实现流程图。
...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种批发酵提升鸭疫里默氏菌明胶液化酶产量的方法，其特征在于，所述批发酵提升鸭疫里默氏菌明胶液化酶产量的方法包括：步骤一，对血清1型鸭疫里默氏菌进行批发酵法发酵培养，得到发酵液；步骤二，明胶酶纯化与制备：对发酵液进行离心、沉淀、透析，将得到的回收目标产物采用PBS缓冲液反复冲洗作为明胶酶纯品；步骤三，采用SDS
‑
PAGE方法对明胶液化酶终产物进行分子量测定。2.如权利要求1所述的批发酵提升鸭疫里默氏菌明胶液化酶产量的方法，其特征在于，所述步骤一，具体包括：菌种复苏：冰箱
‑
70℃保存的血清1型鸭疫里默氏菌(RA1)融化后，无菌操作法用接种环取菌泥涂布新鲜制备的巧克力平板，并划线接种后，置培养箱37℃含有5％CO2条件下孵育16
‑
24小时，直至生长出圆润隆起透明的单个菌落；RA1扩大培养：取RA1单个菌落涂布巧克力平板，在平板上长出大量菌丛后，转入1000毫升三角烧瓶的液体培养基过夜培养，调整菌液的OD
600
＝0.6作为发酵种子储备液。该发酵种子液储备液菌体在显微镜下(1000倍油镜)检查菌体饱满，无明显异型性和杂菌；经过血清学检查呈抗体阳性。发酵种子储备液经发酵液放大培养作为发酵种子液；批发酵法培养RA1：在发酵罐中灌注3.5升发酵培养基，待培养基完全溶解后加入RA1复壮发酵种子液，调整发酵罐参数，发酵24小时后测定发酵液的pH值，对发酵终点进行判断。3.如权利要求2所述的批发酵提升鸭疫里默氏菌明胶液化酶产量的方法，其特征在于，所述过夜培养包括：转入装有发酵液体培养基的100毫升三角烧瓶过夜培养，调整菌液的OD
600
＝0.6作为发酵种子液。4.如权利要求2所述的批发酵提升鸭疫里默氏菌明胶液化酶产量的方法，其特征在于，所述培养基完全溶解后调整温度至37.0℃，无菌操作加入1.0％的RA1复壮发酵种子液。5.如权利要求1所述的批发酵提升鸭疫里默氏菌明胶液化酶产量的方法，其特征在于，所述调整发酵罐参数，包括：温度参数：维持37.0℃；溶氧参数：0
‑
4小时溶氧30％，5
‑
12小时20％，13
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24小时10％；搅拌速度参数：0
‑
4小时400rpm，5
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12小时200rpm，13
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24小时100rpm...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄承洪，蒋姝，陈虹洁，王白雪，
申请(专利权)人：重庆轻工职业学院，
类型：发明
国别省市：