半胱天冬酶-2变体制造技术

本发明专利技术涉及一种单链环状变换的半胱天冬酶

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】半胱天冬酶
‑
2变体


[0001]本专利技术总体上涉及用于产生和使用修饰的半胱天冬酶
‑
2，特别是环状变换的半胱天冬酶
‑
2的分子生物学、生物技术或生物工艺工程领域。本专利技术进一步涉及重组蛋白构建体的产生和分离，特别是通过使用修饰的半胱天冬酶
‑
2来使包含半胱天冬酶识别位点的重组融合蛋白或多肽成熟。

技术介绍

[0002]尽管最近有生物技术方面的所有进展，但由于蛋白质的多样化特征，蛋白质的产生仍然具有挑战性。通常必须针对每种蛋白质优化方案，这对于大规模生产尤其成问题。
[0003]蛋白质的多样化特征使其纯化具有挑战性并阻碍了一般方案。这就是蛋白质经常与具有特殊结合特性的标签融合的原因。首批已在大肠杆菌中重组表达的人蛋白质生长抑素[1]和胰岛素[2]是融合蛋白。即使在今天，蛋白质标签仍广泛用于重组蛋白生产，不仅有助于纯化和检测，而且还可以增强表达和溶解性。稳定表达并增加溶解性的常用标签为例如GST(谷胱甘肽S
‑
转移酶)、MBP(麦芽糖结合蛋白)、SUMO(小泛素相关修饰物)或DsbA(蛋白质二硫化物异构酶I)。用于亲和纯化的标签包括His、HA(血凝素抗原)、Strep II和FLAG标签等。
[0004]然而，尽管标签是多功能且有用的，但去除它们也很困难。对于许多应用尤其是医疗应用来说，无标签蛋白质是必不可少的。标签可以影响蛋白质的结构和特征，因此也会改变对免疫原的反应或触发免疫反应本身[3]。尤其是对于生物制药应用来说，有效从产物切割标签的蛋白酶是必不可少的[4]。
[0005]多种用于去除标签的蛋白酶是可获得的。它们都在限定的识别序列处切割，这些识别序列插入在标签与目的蛋白之间。通常蛋白酶本身具有标签，并随后在第二个纯化步骤中被去除。最常用的是内肽酶，如Xa因子、凝血酶、TEV(烟草蚀纹病毒蛋白酶)和肠激酶。然而，所有这些蛋白酶都具有一个或几个缺点：它们低效且非特异性地切割，不接受P1'位置处的所有残基，在N末端留下突出残基，或者它们需要特殊的不利于目标蛋白的缓冲条件。工业应用的另一个主要缺点是这些蛋白酶的成本高[5]。
[0006]尽管存在半胱天冬酶的研究比其他蛋白酶类别更深入并且半胱天冬酶具有相当高的特异性的事实，但它们几乎从未被考虑用于像标签切割等生物技术目的。
[0007]半胱天冬酶是半胱氨酰天冬氨酸特异性蛋白酶的首字母缩略词，这是一类由保守的催化性半胱氨酸、以及它们强烈偏向于在天冬氨酸残基后切割其底物定义的蛋白酶[6]。第一个半胱天冬酶于20世纪90年代初被描述，从那时起，在哺乳动物中总共发现了15种，其中13种在人中发现[7]。它们以其在调节细胞死亡[8]和炎症反应[9]中的作用而被人熟知。最近发现，它们还参与其他过程，如细胞分化[10]、细胞周期调节[11]，并且甚至可能参与细胞运动[12]。MacKenzie和Clark研究了二聚化在半胱天冬酶形成全功能蛋白酶的能力中的作用，并描述了二聚化是活性位点形成所必需的，因为两种半胱天冬酶单体都贡献了实现形成全功能活性位点的残基(MacKenzie和Clark,Adv Exp Med Biol.(2012)；747:55
‑
73)。
[0008]近年来，已经开发了反向半胱天冬酶，其中半胱天冬酶的小亚基位于半胱天冬酶的大亚基的N末端(US6379950)。
[0009]Srinivasa等人例如描述了重组半胱天冬酶3和6前体，它们具有组成型活性并且其小亚基位于其大亚基之前(Srinivasa等人Journal of Biological Chemistry,American Society for Biochemistry and Molecular Biology(1998),273(17):10107
‑
10111)。
[0010]环状变换可以通过重组织蛋白质的多肽链来提供潜在的益处，然而，通过经由共价接头连接天然蛋白质末端并通过切割现有肽键引入新末端，环状变换也可扰乱局部三级结构和蛋白质动力学，以及引入可能的四级结构变化和问题(Yu和Lutz,Trends in Biotechnology(2011),29(1):18
‑
25)。
[0011]WO 2009/044988 A1描述了一种使用能够被过表达而没有细胞毒性(因为半胱天冬酶的自激活识别位点被非半胱氨酸蛋白酶识别位点替代以在大肠杆菌中的大量表达期间消除自激活活性)的重组半胱天冬酶表达载体产生半胱天冬酶的方法。
[0012]已经公布了三种使用半胱天冬酶以去除标签的系统，这些系统由于使用了不同的融合蛋白、缓冲液、底物与酶比率以及孵育温度，因此难以进行比较。
[0013]半胱天冬酶
‑
3和具有不可切割前肽(propeptide)(但亚基为野生型顺序)的工程化半胱天冬酶
‑
3已用于从融合蛋白中切割GST标签。经修饰的半胱天冬酶能够在25℃下在约三小时内实现完全的标签切割(半胱天冬酶与底物的摩尔比率为1:80，质量比率为1:100)[13]。在另一种也使用半胱天冬酶
‑
3切割GST标签(半胱天冬酶与底物的质量比率为1:200)的系统中，处理在45min内完成至超过90％，但在30℃下孵育[14]。
[0014]一种具有半胱天冬酶
‑
6的系统也已经公布，它更有效，并且可以在约三十分钟内完成底物的完全切割(半胱天冬酶与底物的摩尔比率为1:500)[15]。
[0015]尽管这些基于半胱天冬酶的标签切割系统已经在十多年前公布，但它们还没有被采用到蛋白质纯化的常见清单中。使用基于半胱天冬酶
‑
3的系统仅公布过一次，用于表达白细胞介素[16]。半胱天冬酶
‑
6系统也仅由来自印度免疫学研究所的两个其他小组使用过，用于纯化结核分枝杆菌[17]和幽门螺杆菌蛋白[18]。
[0016]例如，EP1597369B1披露了一种使用融合蛋白进行蛋白质生产的方法，所述融合蛋白包含目的蛋白和蛋白酶识别位点，其中使用蛋白酶如半胱天冬酶在识别位点处切割融合蛋白。
[0017]US 7604980B2还使用包含目的蛋白和半胱天冬酶识别位点的融合蛋白，以生产目的蛋白。在本公开文本中，半胱天冬酶
‑
6优选用于切割融合蛋白。
[0018]半胱天冬酶在生物技术中没有变得更受欢迎的主要原因可能是其重组产生过程中的挑战。天然半胱天冬酶被合成为无活性酶原，因此为获得活性酶，存在两个主要可能性。亚基可以分开表达，然后在纯化后混合，这使得它们的产生非常复杂[19]。或者，表达半胱天冬酶原，导致自催化激活。然而，该方法通常不完整[20]，因此酶活性可能在批次之间变化[21]。另外，因为半胱天冬酶在大肠杆菌中有活性，所以它们也可以切割细菌蛋白[22]并对生长和产量产生负面影响。此外，半胱天冬酶
...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种单链环状变换的半胱天冬酶
‑
2(cp半胱天冬酶
‑
2)，其从N末端至C末端包含以下结构：i.半胱天冬酶
‑
2的小亚基或其功能活性变体；和ii.半胱天冬酶
‑
2的大亚基或其功能活性变体，其中所述cp半胱天冬酶
‑
2包含一个或多个氨基酸取代，其与不具有所述氨基酸取代的cp半胱天冬酶
‑
2相比，提高了所述cp半胱天冬酶
‑
2的P1'耐受性。2.根据权利要求1所述的cp半胱天冬酶
‑
2，其在以下位置处包含一个或多个氨基酸取代：SEQ ID No.6的位置171、105、172、282、225、83、185、255、或285，或在功能上等同于SEQ ID No.6的位置171、105、172、282、225、83、185、255、或285中任一个的位置，或其任何组合。3.根据权利要求1或2所述的cp半胱天冬酶
‑
2，其包含与所述小亚基的N末端融合的半胱天冬酶
‑
2小亚基前肽(SS前肽)。4.根据权利要求3所述的cp半胱天冬酶
‑
2，其中所述SS前肽在所述SS前肽的C末端包含一个或多个氨基酸取代。5.根据权利要求3或4所述的cp半胱天冬酶
‑
2，其中所述SS前肽在SEQ ID No.2的位置Asp
14
处或在功能上等同于SEQ ID No.11的Asp
347
的位置处包含氨基酸取代，特别地为Asp被取代为Ala。6.根据权利要求1至5中任一项所述的cp半胱天冬酶
‑
2，其还包含一个或多个接头序列，所述接头序列特别是由1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个氨基酸残基组成。7.根据权利要求6所述的cp半胱天冬酶
‑
2，其中所述接头序列包含甘氨酸和/或丝氨酸残基，更特别地所述接头是GS、GGSGG、GSAGSAAGSG、(GS)
n
、GSG或G4S。8.根据权利要求6或7所述的cp半胱天冬酶
‑
2，其中所述接头序列是在所述小亚基与所述大亚基之间的亚基接头序列。9.根据权利要求1至8中任一项所述的cp半胱天冬酶
‑
2，其包含一种或多种C末端或N末端标签，所述标签特别地选自亲和标签、溶解性增强标签和监测标签。10.根据权利要求9所述的cp半胱天冬酶
‑
2，其中所述亲和标签选自聚组氨酸标签、聚精氨酸标签、抗体的肽底物、几丁质结合结构域、RNAse S肽、蛋白A、β
‑
半乳糖苷酶、FLAG标签、Strep II标签、链霉亲和素结合肽(SBP)标签、钙调蛋白结合肽(CBP)、谷胱甘肽S
‑
转移酶(GST)、麦芽糖结合蛋白(MBP)、S
‑
标签、HA标签、c
‑
Myc标签、SUMO标签、大肠杆菌硫氧还蛋白、NusA、几丁质结合结构域CBD、氯霉素乙酰基转移酶CAT、LysRS、泛素、钙调蛋白、和λgpV，特别地所述标签是包含一个或多个His的His标签，更特别是六组氨基标签。11.根据权利要求9所述的cp半胱天冬酶
‑
2，其中所述溶解性增强标签选自T7C、T7B、T7B1、T7B2、T7B3、T7B3、T7B4、T7B5、T7B6、T7B6、T7B7、T7B8、T7B9、T7B10、T7B11、T7B12、T7B13、T7A、T7A1、T7A2、T7A3、T7A4、T7A5、T3、N1、N2、N3、N4、N5、N6、N7、T7AC、钙调蛋白结合肽(CBP)、DsbA、DsbC、聚Arg、聚Lys、GB1结构域、蛋白D、葡萄球菌蛋白A的Z结构域、和硫氧还蛋白。12.根据权利要求9所述的cp半胱天冬酶
‑
2，其中所述监测标签选自m
‑
Cherry、GFP和f
‑
肌动蛋白。13.根据权利要求9至12中任一项所述的cp半胱天冬酶
‑
2，其包含多于一种标签，特别是包含亲和标签和溶解性增强标签。
14.根据权利要求13所述的cp半胱天冬酶
‑
2，其中所述亲和标签是六组氨酸标签，并且所述溶解性增强标签是T7AC或T7A3标签。15.根据权利要求6至14中任一项所述的cp半胱天冬酶
‑
2，其中所述接头序列是标签
‑
接头序列，连接两个标签或连接标签与所述cp半胱天冬酶
‑
2的小亚基、大亚基或SS前肽。16.根据权利要求1至15中任一项所述的cp半胱天冬酶
‑
2，其包含一个或多个N末端标签，以及任选地在所述标签之间或在标签与所述小亚基或所述SS前肽的N末端之间的一个或多个标签
‑
接头序列。17.根据权利要求1至16中任一项所述的cp半胱天冬酶
‑
2，其包含一个或多个C末端标签以及任选地一个或多个标签
‑
接头序列，所述一个或多个标签
‑
接头序列是在所述标签之间或在标签与所述大亚基的C末端之间的接头序列。18.根据权利要求1
‑
17中任一项所述的cp半胱天冬酶
‑
2的功能活性变体，其中i.半胱天冬酶
‑
2的小亚基包含a)活性中心的第一保守区，所述第一保守区与SEQ ID No.177(第一共有序列：AAMRNTKR)具有至少37.5％的氨基酸序列同一性或与XXXRNTXX(SEQ ID No.200)具有100％的序列同一性，其中X是任何氨基酸，b)活性中心的第二保守区，所述第二保守区与SEQ ID No.178(第二共有序列：EGYAPGTEFHRCK)具有至少61.5％的氨基酸序列同一性或与EGXXPGXXXHRCK(SEQ ID No.194)具有100％的序列同一性，其中X是任何氨基酸，并且ii.半胱天冬酶
‑
2的大亚基包含a)活性中心的第三保守区，所述第三保守区与SEQ ID No.174(第三共有序列：G
‑
EKDLEFRSGGDVDH)具有至少25.0％的氨基酸序列同一性或与X
‑
XXXLXXRXGXXXDX(SEQ ID No.195)具有100％的序列同一性，其中X是任何氨基酸，b)活性中心的第四保守区，所述第四保守区与SEQ ID No.175(第四共有序列：LLSHGVEGGXYGVDG)具有至少53.3％的氨基酸序列同一性或与XXSHGXXGXXYGXDG(SEQ ID No.196)具有100％的序列同一性，其中X是任何氨基酸，并且c)活性中心的第五保守区，所述第五保守区与SEQ ID No.176(第五共有序列：QACRGDET)具有至少50.0％的氨基酸序列同一性或与QACXGXXX(SEQ ID No.197)具有100％的序列同一性，其中X是任何氨基酸。19.cp半胱天冬酶
‑
2的功能活性变体，其包含与根据权利要求1至18中任一项所述的cp半胱天冬酶
‑
2的至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％或98％的序列同一性。20.根据权利要求19所述的功能活性变体，其包含与SEQ ID No.9、6、14、15、16、80、88、25、26、27、28、29、30、35、39、41、64、66、68、73、74、75、76、77、81、82、83、84、或85的至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％或98％的序列同一性。21.根据权利要求1至20中任一项所述的cp半胱天冬酶
‑
2，其中i.所述小亚基选自SEQ ID No.3、SEQ ID No.91、SEQ ID No.94、SEQ ID No.97、SEQ ID No.100、SEQ ID No.103、SEQ ID No.106、SEQ ID No.109、SEQ ID No.112、SEQ ID No.115、SEQ ID No.118，或其具有至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、
96％、97％或98％序列同一性的功能活性变体，和/或ii.所述大亚基选自SEQ ID No.4、SEQ ID No.90、SEQ ID No.93、SEQ ID No.96、SEQ ID No.99、SEQ ID No.102、SEQ ID No.105、SEQ ID No.108、SEQ ID No.111、SEQ ID No.114、SEQ ID No.117，或其具有至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％或98％序列同一性的功能活性变体。22.根据权利要求1至21中任一项所述的cp半胱天冬酶
‑
2，其包含i.N末端和/或C末端截短，和/或ii.N末端和/或C末端延伸。23.根据权利要求1至22中任一项所述的cp半胱天冬酶
‑
2，其包含选自以下的一个或多个氨基酸取代：i.Gly
171
，被D或选自R、K、E、Q、N、A、S、T、P、H、Y的氨基酸取代ii.Glu
105
，被V或选自C、L、I、M、F、W、R、K、D、Q、N的氨基酸取代iii.Glu
172
，被V或选自C、L、I、M、F、W、R、K、D、Q、N的氨基酸取代iv.Asp
282
，被E或T或选自R、K、Q、N、G、A、S、P、H、Y的氨基酸取代v.Val
225
，被G或选自A、S、T、P、H、Y、C、L、I、M、F、W的氨基酸取代vi.Lys
83
，被E或选自R、D、Q、N的氨基酸取代，vii.His
185
，被A或选自G、S、T、P、Y的氨基酸取代，viii.Val
255
，被M或选自C、L、I、F、W的氨基酸取代，和/或ix.Asp
285
，被E或Y或选自R、K、Q、N、G、A、S、T、P、H的氨基酸取代，均参考SEQ ID No.6的位置或功能上等同于SEQ ID No.6的位置的位置。24.根据权利要求1至22中任一项所述的cp半胱天冬酶
‑
2，其在选自以下的SEQ ID No.6的位置处或功能上等同于SEQ ID No.6的位置的位置处包含氨基酸取代：i.His
185
和Asp
282
，特别包括H185A和D282T取代；ii.Glu
105
和Asp
285
，特别包括E105V和D285E取代；iii.Glu
105
、Gly
171
、Val
225
和Asp
282
，特别包括E105V、G171D、V225G和D282E取代；iv.Glu
105
、Gly
171
、Val
225
、Asp
282
和Asp
285
，特别包括E105V、G171D、V225G、D282E和D285E取代；v.Lys
83
、Glu
105
、Glu
172
、Val
255
和Asp
285
，特别包括K83E、E105V、E172V、V255M和D285Y取代；vi.Glu
105
和Gly
171
，特别包括E105V和G171D取代；vii.Glu
105
和Glu
172
，特别包括E105V和E172V取代；和viii.Gly
171
和Glu
172
，特别包括G171D和E172V取代，其中所述cp半胱天冬酶
‑
2与不具有相应氨基酸取代的cp半胱天冬酶
‑
2相比具有提高的P1'耐受性，任选地其中所述cp半胱天冬酶
‑
2包括在SEQ ID No.2的位置Asp
14
处或在功能上等同于SEQ ID No.11的位置Asp
347
的位置处包含至Ala的氨基酸取代的SS前肽。25.根据权利要求1至22中任一项所述的cp半胱天冬酶
‑
2，其包含SEQ ID No.6以及在以下位置处的一个或多个氨基酸取代：SEQ ID No.6的位置171、105、172、282、225、83、185、255、或285，或在功能上等同于SEQ ID No.6的位置171、105、172、282、225、83、185、255、或285的位置处，或其任何组合。
26.根据权利要求25所述的cp半胱天冬酶
‑
2，其包含氨基酸取代G171D、E105V、E172V、D282E、D282T、V225G、K83E、H185A、V255M、D285Y和D285E中的任何一种或多种。27.根据权利要求1至26中任一项所述的cp半胱天冬酶
‑
2，其包含选自SEQ ID No.1、13、17、18、23、24、51、52、54、70、71、72、78、79、86、87、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191和192的氨基酸序列，或与SEQ ID No.1、13、17、18、23、24、51、52、54、70、71、72、78、79、86、87、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191和192中的任一个具有至少70％、75％、80％、85％、90％，特别是至少95％，特别是至少99％序列同一性的氨基酸序列。28.根据权利要求1至27中任一项所述的cp半胱天冬酶
‑
2，其包含C末端标签以及在SEQ ID No.6的位置285和292处或在功能上等同于SEQ ID No.6的位置285和292的位置处的氨基酸取代，特别包含至Glu和Ser的取代(D285E和D292S)。29.根据权利要求1至28中任一项所述的cp半胱天冬酶
‑
2，其中所述cp半胱天冬酶
‑
2通过蛋白水解切割的识别位点募集，所述识别位点包含序列P5 P4 P3 P2 P1的5个氨基酸，其中P1可以是任何氨基酸，优选为D或E，P2可以是任何氨基酸，优选为A，P3可以是任何氨基酸，优选为V，P4可以是任何氨基酸，优选为D，并且P5可以是任何氨基酸，优选为V。30.一种产生环状变换的半胱天冬酶
‑
2(cp半胱天冬酶
‑
2)的方法，其包括以下步骤：i.将在启动子控制下的编码cp半胱天冬酶
‑
2的核苷酸序列克隆到表达载体中，ii.用所述载体转化宿主细胞，iii.在其中所述cp半胱天冬酶
‑
2得以表达的条件下培养转化的宿主细胞，iv.任选地从宿主细胞培养物中分离所述cp半胱天冬酶
‑
2，任选地通过分解所述宿主细胞进行所述分离，以及v.任选地纯化所述cp半胱天冬酶
‑
2。31.根据权利要求30所述的方法，其中所述cp半胱天冬酶
‑
2是根据权利要求1至29中任一项所述的cp半胱天冬酶
‑
2。32.根据权利要求30或31所述的方法，其中所述启动子选自T7启动子/操作子、XylS/Pm调节子/启动子或Pm启动子的变体、araBAD启动子/操作子、T5、T7A1、T7A2、T7A3启动子/操作子、phoA启动子/调节子、以及trp启动子/操作子系统。33.根据权利要求30至32中任一项所述的方法，其中所述cp半胱天冬酶
‑
2包含选自以下的溶解性增强标签：T7C、T7B、T7B1、T7B2、T7B3、T7B3、T7B4、T7B5、T7B6、T7B6、T7B7、T7B8、T7B9、T7B10、T7B11、T7B12、T7B13、T7A、T7A1、T7A2、T7A3、T7A4、T7A5、T7AC、T3、N1、N2、N3、N4、N5、N6、N7、钙调蛋白结合肽(CBP)、DsbA、DsbC、聚Arg、聚Lys、G B1结构域、蛋白D、葡萄球菌蛋白A的Z结构域、和硫氧还蛋白标签，优选包含T7AC或T7A3标签。34.根据权利要求30至33中任一项所述的方法，其中所述cp半胱天冬酶
‑
2包含亲和标签，优选His标签，并且甚至更优选6
‑
His标签。35.根据权利要求30至34中任一项所述的方法，其中所述宿主细胞是真核或原核宿主
细胞，优选酵母细胞或细菌细胞，并且甚至更优选大肠杆菌细胞。36.根据权利要求30至35中任一项所述的方法，其中所述cp半胱天冬酶
‑
2包含N末端标签，所述N末端标签包含亲和标签和溶解性增强标签，所述亲和标签优选His标签并且甚至更优选6
‑
His标签，所述溶解性增强标签优选T7AC或T7A3。37.根据权利要求36所述的方法，其中所述cp半胱天冬酶
‑
2还包含在所述亲和标签与所述溶解性增强标签之间的接头。38.根据权利要求36或37所述的方法，其中所述cp半胱天冬酶
‑
2按从N末端至C末端的顺序包含融合至其N末端的以下元件：a.亲和标签，优选6
‑
His标签；b.任选地接头；c.溶解性增强标签，优选T7AC或T7A3；d.任选地接头；以及e.cp半胱天冬酶
‑
2，其包含在所述大亚基N末端的小亚基。39.根据权利要求36或37所述的方法，其中所述cp半胱天冬酶
‑
2按从N末端至C末端的顺序包含以下结构：a.溶解性增强标签，优选T7AC或T7A3；b.任选地接头；c.亲和标签，优选6
‑
His标签；d.任选地接头；以及e.cp半胱天冬酶
‑
2，其包含在所述大亚基N末端的小亚基。40.根据权利要求30至39中任一项所述的方法，其中步骤(iii)的培养包括用于表达cp
‑
半胱天冬酶
‑
2的分批补料阶段，所述分批补料阶段特别包括约0,01
‑
0,1h
‑1的生长速率μ以及通过以约0,01
–
1,5μmol/g实际CDM(细胞干质量)的浓度添加IPTG诱导所述cp
‑
半胱天冬酶
‑
2的表达。41.根据权利要求40所述的方法，其中所述生长速率μ为约0,03

【专利技术属性】
技术研发人员：A，
申请(专利权)人：勃林格殷格翰RCV两合公司，
类型：发明
国别省市：