本发明专利技术公开了一种适用于任一时期小鼠脑组织细胞分离的酶解液，以及使单细胞悬液低损失的优化方法，本发明专利技术所述的方法得到单细胞悬液中活细胞占比优于现有技术方法。这些优点可以让本领域技术人员完成小鼠各个时期脑组织细胞的分离且取得高活率、高得率、低杂质占比的细胞悬液，或使分离得到的细胞能继续应用于后续单细胞测序实验中，拿到更加真实且有意义的结果，为进一步明晰疾病机理和疾病的治疗提供了更完备的保障。供了更完备的保障。
【技术实现步骤摘要】
一种适用于酶解小鼠脑组织的酶解液、细胞分离的方法及其应用
[0001]本专利技术属于生物
，涉及一种适用于酶解小鼠脑组织的酶解液、细胞单细胞悬液的制备方法及其应用。
技术介绍
[0002]单细胞测序技术自问世以来，对生命科学研究产生了颠覆式的影响，革新了众多领域的研究范式与基本方法，如免疫生物学、肿瘤生物学、发育生物学等。在脑科学研究中，单细胞测序对解析神经元在特定生理、病理状态下的功能，鉴别不同细胞在发育或疾病进展中的作用带来了详尽的数据，揭示了深刻的分子机理机制，也已成为脑科学研究中最强有力的技术手段。其流程包括四个操作步骤：样本制备、单细胞分离、测序、数据分析。其中样本制备是最为关键的第一步，其质量决定了后续操作的成败。
[0003]目前，脑科学研究中小鼠是最为常用的模式动物，但不同时期的小鼠脑组织结构复杂，脑组织在样本制备过程中存在诸多问题，如细胞活率低、纯度低、部分细胞无法获得等，极大的限制了单细胞测序技术的应用，对结果的可靠性产生了很大影响，如《Derivation of Enriched Oligodendrocyte Cultures and Oligodendrocyte/Neuron Myelinating Co
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Cultures from Post
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Natal Murine Tissues》一文中对小鼠脑组织的解离方法。仅适用于新生鼠1
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7天的脑组织细胞分离，对中年、老年鼠脑组织细胞分离则会出现细胞数量极少、结团率高等问题，无法应用于中年、老年鼠脑组织。而《Pharmacological Inhibition ofMitochondrial Carbonic Anhydrases Protects Mouse Cerebral Pericytes from High Glucose
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Induced Oxidative Stress andApoptosis》文献报道的制备单细胞悬液的方法适用于12周小鼠脑组织的分离，对新生鼠单细胞分离效果不理想，呈现细胞数量及类型均偏少的现象。因此，现有技术中单一的酶解配方，无法适用于任一时期的鼠脑组织单细胞分离。
[0004]综上，现有技术对不同时期小鼠的解离结果差异较大。其关键点在于酶解液配方，酶解液配方的变化会改变组织解离的偏好性，而对于单细胞测序来说，解离的偏好性会导致本领域技术人员无法全面的更深层次挖掘数据，无法全面了解脑组织的内在机理。因此，急需一种同时适用于各个发育时期小鼠脑组织的细胞分离方法来解决这一问题，推进脑科学基础科研进程。
技术实现思路
[0005]为克服现有技术存在的缺陷，本专利技术提出了一种适用于任一时期小鼠脑组织细胞分离的酶解液，以及使单细胞悬液低损失的优化方法，本专利技术所述的方法得到单细胞悬液中活细胞占比优于目前现有技术方法(本专利技术制备的单细胞悬液中活细胞占比为90％
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95％、碎片杂质占比为1％～10％、细胞结团占比为1％～5％，现有技术分别对应为80％
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90％、10％
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20％、1％
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10％)。本专利技术可以使组织分离得到的单细胞数量更多酶解后得率为
5
×
106‑7×
106，经过优化后的悬液质量更为优质，纯度更高，碎片占比为1％
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10％，结团占比为1％
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5％，损失更低，优化后细胞数量为3
×
106～6
×
106个。对于进行后续单细胞测序研究有着更高的价值，这些优点可以让本领域技术人员完成小鼠各个时期脑组织细胞的分离且取得高活率、高得率、低杂质占比的细胞悬液，或使分离得到的细胞能继续应用于后续单细胞测序实验中，得到更加真实且有意义的结果，为进一步明晰疾病机理和疾病的治疗提供了更完备的保障。
[0006]本专利技术提出了一种适用于小鼠脑组织细胞分离的酶解液，包括木瓜蛋白酶，胶原酶I，DNase I。
[0007]其中，所述酶解液中各组分的浓度为木瓜蛋白酶10～20U/mL，胶原酶I0.1～0.2％(m/v)，DNase I 30～75U/mL；优选地，为木瓜蛋白酶10U/mL，胶原酶I 0.1％(m/v)，DNase I 30U/mL。
[0008]进一步地，本专利技术所述酶解液还包括HBSS(含钙镁离子)缓冲液作为酶解缓冲液，钙离子可以增强胶原酶的消化作用，所述缓冲液可以保障胶原酶有着较高的酶活。
[0009]所述酶解液组分分别购自木瓜蛋白酶(Sigma Aldrich,P4762
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1G)，胶原酶I(Gibco,17018029)，DNase I(Applichem,A3778
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0050)。
[0010]其中，所述小鼠脑组织细胞任选任一时期小鼠脑组织细胞。
[0011]本专利技术还提出了所述酶解液在小鼠脑组织细胞分离中的应用。
[0012]本专利技术还提出了一种小鼠脑组织细胞分离的方法，具体包括以下步骤：
[0013](1)配制酶解液：将木瓜蛋白酶，胶原酶I和DNase I同时加入HBSS缓冲液中配制酶解液，然后经过滤膜过滤后使用。
[0014](2)组织清洗：取出小鼠脑组织后，使用预冷的DPBS冲洗组织表面，冲洗去除沾染的血液。
[0015](3)组织酶解：将冲洗干净后的组织剪切成小块，加入所述步骤(1)配制的酶解液，酶解期间使用摇床进行混匀使酶解液与组织充分接触。
[0016](4)辅助释放：加入含有FBS胎牛血清的DPBS终止酶解，使用宽口吸管吸打悬液以帮助细胞释放到悬液中。
[0017](5)染色镜检：染色镜检并计算酶解后细胞数量和细胞活率。
[0018](6)筛网过滤：使用细胞筛网过滤酶解液，滤液离心富集细胞。
[0019](7)碎片去除：使用细胞碎片去除溶液(Debris removal solution)，并按照相关SOP操作去除悬液中的杂质。
[0020](8)红细胞裂解：使用红细胞裂解液进行红细胞裂解。
[0021](9)细胞洗涤：DPBS洗涤细胞，以去除环境RNA，得到鼠脑组织细胞。
[0022]在一个优选的实施方式中，所述制备方法包括如下具体步骤：
[0023](1)配制酶解液：木瓜蛋白酶，胶原酶I，DNase I同时加入HBSS缓冲液中配制酶解液，然后经过滤膜过滤后使用。
[0024](2)组织清洗：取出小鼠脑组织后，使用预冷的DPBS冲洗组织表面，尽可能冲洗去除沾染的血液。
[0025](3)组织酶解：用虹膜剪将组织剪切成1mm3左右的小块，加入酶解液，酶解期间使用摇床进行混匀使酶解液与组织充分接触。
[0026](4)辅助释放：加入含有FBS胎牛血清的DPBS终止酶解，使用宽口吸管吸打悬液10
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15次以帮助细胞释放到悬液中。
[本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种适用于小鼠脑组织分离的酶解液，其特征在于，包括木瓜蛋白酶，胶原酶I，DNase I。2.如权利要求1所述的酶解液，其特征在于，所述酶解液中各组分的浓度为木瓜蛋白酶10～20U/mL，胶原酶I 0.1～0.2％(m/v)，DNase I 30～75U/mL。3.如权利要求1所述的酶解液，其特征在于，所述酶解液还包括使用含有钙镁离子的HBSS缓冲液作为酶解缓冲液。4.一种小鼠脑组织细胞分离的方法，其特征在于，具体包括以下步骤：(1)配制酶解液：将木瓜蛋白酶，胶原酶I和DNase I同时加入HBSS缓冲液中配制酶解液，然后经过滤膜过滤后使用；(2)组织清洗：取出小鼠脑组织后，使用预冷的DPBS冲洗组织表面；(3)组织酶解：将所述步骤(2)冲洗后的组织剪切成小块，加入所述步骤(1)配制的酶解液，酶解期间使用摇床进行混匀使酶解液与组织充分接触；(4)辅助释放：加入含有FBS胎牛血清的DPBS终止酶解，使用宽口吸管吸打悬液以帮助细胞释放到悬液中；(5)染色镜检：染色镜检并计算酶解后细胞数量和细胞活率；(6)筛网过滤：使用细胞筛网过滤酶解液，滤液离心富集细胞；(7)碎片去除：使用细胞碎片去除溶液，并按照试剂盒SOP操作去除细胞悬液中的杂质；(8)红细胞裂解：使用红细胞裂解液进行红细胞裂解；(9)细胞洗涤：DPBS洗涤细胞，以去除环境RNA，得到所述小鼠脑组织细胞。5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤1中，所述木瓜蛋白酶的浓度为10～20U/mL，胶原酶I的浓度为0.1～0.2％(m/v)，DNase I的浓度为30～75U/mL；和/或，过滤酶解液用滤膜规格为0.22μm Millipore,SLGPR33RB。6.如权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤2中，所述小鼠脑组织为任一时期小鼠脑组织；预冷的DPBS的温度为0～4℃；预冷的DPBS冲洗组织次数为3～5次；步骤3中，所述酶解液的用量为4～6mL；所述摇床的转速为90～120r...
【专利技术属性】
技术研发人员：范黎明，殷昊，朱燕敏，王佳琦，肖云平，
申请(专利权)人：上海欧易生物医学科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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