一种重组鲎三因子组合物及其检测内毒素的方法技术

本发明专利技术提供了一种重组鲎三因子组合物及其应用，该组合物包括重组鲎C因子、重组鲎B因子和重组鲎凝固酶原因子；所述重组鲎C因子、重组鲎B因子和重组鲎凝固酶原因子均由哺乳动物细胞HEK293表达。由此通过哺乳类细胞HEK293表达C因子、B因子和PCE因子，三种因子同时表达增强C因子活性，提高灵敏度，并且表达后的因子是可分泌和具有较高活性的。可分泌和具有较高活性的。

【技术实现步骤摘要】
一种重组鲎三因子组合物及其检测内毒素的方法


[0001]本专利技术属于生物工程
，具体涉及一种重组鲎三因子组合物及其检测内毒素的方法。

技术介绍

[0002]内毒素是存在于革兰氏阴性细菌的细胞壁外膜上的脂多糖，且已知是强致热原。内毒素只有当细菌死亡溶解或用人工方法破坏细菌细胞后才释放出来，它可以激活中性粒细胞等，使之释放出一种内源性热原质，作用于体温调节中枢引起发热，休克甚至死亡，因而内毒素检测的药厂制药和医疗设备制造中必须的一道程序。
[0003]鲎试验是国际上至今为止检测内毒素的金标准，具有简单、快速、灵敏度高等特点。传统的鲎试验是使用鲎血细胞提取液(鲎的变形细胞溶解物)进行测定。在内毒素与溶解物接触后，存在于溶解物中的作为丝氨酸蛋白酶前体的C因子被活化而生成活化型C因子；该活化型C因子使存在于溶解物中的B因子活化，生成活化型B因子，该活化型B因子使存在于溶解物种的凝固酶原活化，生成凝固酶，凝固酶再被水解成凝固蛋白凝胶或者是将其与合成底物发生作用而显色以测定内毒素。然而，使用鲎血细胞提取液使得海洋中鲎的数量逐渐减少。
[0004]相关技术中，使用昆虫细胞或者哺乳动物细胞作为宿主细胞来表达C因子、B因子及凝固酶原，重构级联反应体系，但是其表达的C因子为不溶性、非分泌和低活性的。

技术实现思路

[0005]本专利技术旨在至少在一定程度上解决上述技术中的技术问题之一。为此，本专利技术提出了一种重组鲎三因子组合物，使用哺乳类细胞HEK293表达C因子、B因子和PCE因子，三种因子同时表达增强C因子活性，提高灵敏度，并且表达后的因子是可分泌和具有相对较高的活性。
[0006]为此，在本专利技术的第一个方面中，提供了一种重组鲎三因子组合物，包括重组鲎C因子、重组鲎B因子和重组鲎凝固酶原因子；所述重组鲎C因子、重组鲎B因子和重组鲎凝固酶原因子均由哺乳动物细胞HEK293表达。
[0007]根据本专利技术的实施例，采用哺乳动物细胞HEK293同时表达鲎C因子、鲎B因子和鲎凝固酶原因子，将这三因子用于内毒素检测，半小时即可获定性定量的检测内毒素，三种因子同时表达增强C因子活性，提高灵敏度，并且表达后的因子是可分泌和具有较高活性的。
[0008]可选地，所述重组鲎C因子的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，所述重组鲎B因子的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示，所述重组鲎凝固酶原因子的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。由此通过密码子优化，使得三因子更适于哺乳细胞表达。
[0009]可选地，所述重组鲎C因子、重组鲎B因子和重组鲎凝固酶原因子的制备包括如下步骤：
[0010](1)以SEQ ID NO：4所示的基因为模板，SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9为引物对C因子
进行PCR扩增，获得FactorC
‑
his6
‑
ApaI；以SEQ ID NO：5所示的基因为模板，SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11为引物对B因子进行PCR扩增，获得FactorB
‑
his6
‑
ApaI；以SEQ ID NO：6所示的基因为模板，SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13为引物对PCE因子进行PCR扩增，获得PCE
‑
his6
‑
ApaI；以SEQ ID NO：7所示的基因为模板，SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17为引物对gp67进行PCR扩增，获得KpnI
‑
gp67
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1、KpnI
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gp67
‑
2和KpnI
‑
gp67
‑
3；
[0011](2)将KpnI
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gp67
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1基因片段与FactorC
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his6
‑
ApaI基因片段连接，获得KpnI
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gp67
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FactorC
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his6
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ApaI；将KpnI
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gp67
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2基因片段与FactorB
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his6
‑
ApaI基因片段连接，获得KpnI
‑
gp67
‑
FactorB
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his6
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ApaI；将KpnI
‑
gp67
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3基因片段与PCE
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his6
‑
ApaI基因片段连接，获得KpnI
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gp67
‑
PCE
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his6
‑
ApaI；
[0012](3)将KpnI
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gp67
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FactorC
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his6
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ApaI基因片段、KpnI
‑
gp67
‑
FactorB
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his6
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ApaI基因片段和KpnI
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gp67
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PCE
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his6
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ApaI基因片段分别与pcDNA载体连接，获得重组质粒pcDNA
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gp67
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factorC、pcDNA
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gp67
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factorB和pcDNA
‑
gp67
‑
PCE，重组质粒再转染哺乳动物细胞HEK293，培养表达纯化蛋白，获得重组鲎C因子、重组鲎B因子和重组鲎凝固酶原因子。
[0013]在本专利技术的第二方面中，提供了一种应用上述重组鲎三因子组合物检测内毒素的方法，包括如下步骤：
[0014](1)配置至少3个不同浓度的内毒素标准液；
[0015](2)将所述重组鲎C因子、重组鲎B因子和重组鲎凝固酶原因子与荧光底物、细菌内毒素检查用水和buffer混合制得混合液；
[0016](3)将所述混合液与每个所述的内毒素标准液按1:1的体积加入微孔板中，同时设置阴性对照组；
[0017](4)将微孔板置于荧光微孔板检测仪中检测；
[0018](5)以荧光强度变化值为纵坐标，内毒素标准溶液的溶度为横坐标，做标准曲线。
[0019]根据本专利技术实施例检测内毒素的方法，通过上述鲎三因子组合物可提高检测的灵敏度，大大的缩短检测时间。
[0020]本专利技术的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本专利技术的实践了解到。
附图说明
[0021]图1为根据本专利技术实施例的扩增后的电泳验证图；
[0022]图2为根据本专利技术实施例的C因本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种重组鲎三因子组合物，其特征在于，包括重组鲎C因子、重组鲎B因子和重组鲎凝固酶原因子；所述重组鲎C因子、重组鲎B因子和重组鲎凝固酶原因子均由哺乳动物细胞HEK293表达。2.如权利要求1所述的重组鲎三因子组合物，其特征在于，所述重组鲎C因子的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，所述重组鲎B因子的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示，所述重组鲎凝固酶原因子的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。3.如权利要求1所述的重组鲎三因子组合物，其特征在于，所述重组鲎C因子、重组鲎B因子和重组鲎凝固酶原因子的制备包括如下步骤：(1)以SEQ ID NO：4所示的基因为模板，SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9为引物对C因子进行PCR扩增，获得FactorC
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his6
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ApaI；以SEQ ID NO：5所示的基因为模板，SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11为引物对B因子进行PCR扩增，获得FactorB
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his6
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ApaI；以SEQ ID NO：6所示的基因为模板，SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13为引物对PCE因子进行PCR扩增，获得PCE
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his6
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ApaI；以SEQ ID NO：7所示的基因为模板，SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17为引物对gp67进行PCR扩增，获得KpnI
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gp67
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1、KpnI
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gp67
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2和KpnI
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gp67
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3；(2)将KpnI
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gp67
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1基因片段与FactorC
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his6
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ApaI基因片段连接，获得KpnI
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gp67
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FactorC
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his6
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ApaI；将KpnI
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gp67
‑
2基因...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴海苹，罗贵峰，吴尚毅，吴冠辰，
申请(专利权)人：厦门鲎试剂生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：