用于无质粒产生目的蛋白的诱导型表达系统技术方案

公开了一种用于在原核宿主中产生目的蛋白(POI)的基于基因组的表达系统，所述表达系统至少包含RNA聚合酶(RNAP)基因；编码POI的基因，所述基因包含编码序列，与所述编码序列可操作地连接的启动子，其中所述启动子由从所述RNAP基因表达的RNAP识别，和所述启动子的序列内的至少一个lac操纵基因(lacO)；以及编码lac阻遏蛋白(LacI)的lacI基因，所述lacI基因包含编码序列、与所述lacI编码序列可操作地连接的lacI启动子，其中所述lacI启动子是野生型lacI启动子或增加LacI表达的lacI启动子；其中所述POI的表达率由结合LacI的诱导剂调节。POI的表达率由结合LacI的诱导剂调节。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于无质粒产生目的蛋白的诱导型表达系统


[0001]本专利技术涉及用于在原核宿主中表达目的蛋白的无质粒诱导型系统的领域。本专利技术还涉及使用此类系统在原核宿主中产生目的蛋白的方法。

技术介绍

[0002]在工业蛋白质生产过程中，基因调节是重要的前提。转录率由启动子和RNA聚合酶(RNAP)的相互作用控制。对这种相互作用的理解和外部调节对于提供过程控制和产品产量和质量的优化是必要的。降低启动子强度可能是有益的，特别是对于具有挑战性的蛋白质，如抗体片段、膜蛋白或毒性蛋白(1
‑
3)。可溶且正确折叠蛋白的最终产物产量通常不直接由启动子系统的强度决定，而是由肽链的进一步加工决定，如转位到周质和正确的二硫键形成。
[0003]最突出且研究得最好的遗传调节机制是lac操纵子(4)。在野生型大肠杆菌(E.coli)中，lac抑制物(LacI)形成与lac操纵基因序列(lacO)结合并阻遏lacZYA操纵子转录的同四聚体(5)。在乳糖或不可代谢的异丙基β
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D
‑1‑
硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)的存在下，LacI的结构发生改变，并且不能再与lac操纵基因结合，从而导致诱导转录。lac操纵基因位点是具有反向重复对称性的DNA序列(6)。
[0004]对称性越高，LacI与操纵基因序列的结合亲和力越大。发现人工完全对称的lacO(sym
‑
lacO)以最大亲和力结合LacI(7)，而表现出近似对称性的三个野生型操纵基因lacO1、lacO2和lacO3显示出较低亲和力，从而导致以下顺序：sym
‑
lacO>lacO1>lacO2>lacO3(8)。LacI通过DNA环化机制同时与主操纵基因lacO1以及lacO2或lacO3结合(9)。lacO2位于lacO1下游401bp，而lacO3位于lacO1上游仅92bp(10)。lacO2的作用仍不清楚，因为对阻遏的主要贡献来自lacO1和lacO3的DNA环化，因为它们更接近(8)。此外，当lacO1和lacO3被LacI结合时，阻止了LacI本身的产生。lacI基因的3'端与lacO3重叠。在阻遏状态下，lacI的转录产生截短的mRNA，其被细胞快速降解。由于这种自动调节，LacI四聚体的浓度在诱导的细胞中为约40个分子，并且在非诱导的细胞中为约15个分子(11)。
[0005]存在LacI阻遏蛋白和pLacI启动子的几种突变体。Penumetcha等人测试了阻遏物和启动子突变体的各种组合，试图发现在转录中渗漏性降低的系统。他们报告了野生型LacI阻遏蛋白与pLacI
Q1
启动子的组合使用产生高水平的诱导作用和低水平的渗漏转录(34)。
[0006]Oehler等人测试了大肠杆菌(Escherichia coli)的染色体lac操纵子的全部三个lac操纵基因的系统破坏对Lac阻遏物阻遏的影响，并且报告了lac操纵子的三个操纵基因在阻遏中合作(35)。
[0007]四聚体Lac阻遏物可以同时与同一DNA分子上的两个lac操纵基因结合，从而包括形成DNA环。M
ü
ller等人报告了随着操纵基因间DNA长度的减少，阻遏显著增加(36)。
[0008]已测试了将lac操纵基因放置在相对于噬菌体T7 RNA聚合酶启动子的不同位置处的影响。转录可以被lac阻遏物强烈阻遏，所述阻遏物与RNA起点下游15个碱基对的操纵基
因结合(37)。
[0009]WO 2003/050240A2公开了用于在宿主细胞中产生靶蛋白的表达系统，所述表达系统包含编码T7 RNA聚合酶的同源整合基因和编码靶蛋白的非整合基因。
[0010]lac调节机制的最早应用之一是pET系统，所述系统当今是用于重组蛋白生产的最广泛使用的大肠杆菌表达系统(12,13)。此系统是基于T7噬菌体衍生的T7 RNAP与强T7启动子的特异性相互作用。噬菌体λ的重组酶功能用于将T7 RNA聚合酶基因定点插入大肠杆菌基因组中。T7 RNAP的表达由lacUV5启动子控制，所述启动子是乳糖启动子的对分解代谢阻遏不敏感的变体。添加IPTG诱导T7 RNAP的高水平表达，所述T7 RNAP进而转录在T7启动子控制下的靶基因。此正交表达系统为可以在大肠杆菌中高效产生的重组蛋白提供了非常高的产物滴度。然而，T7表达系统的超常强度(特别是如果与高拷贝数质粒组合的话)对宿主细胞施加极端的代谢负荷。当目的基因编码具有挑战性的蛋白质时，应力和代谢负担往往导致产量降低、生产周期缩短，甚至细胞死亡(14,15)。
[0011]质粒介导的应力效应(如高基因剂量和抗生素抗性基因的转录)可以通过将目的基因(GOI)(即编码目的蛋白的基因)整合到宿主基因组中来克服(16,17)。
[0012]WO 2008/142028 A1公开了用于产生目的蛋白的方法，其中将编码目的蛋白的DNA在预先选择的位点处整合到细菌细胞基因组中。
[0013]Striedner等人公开了基于T7的无质粒大肠杆菌表达系统，其中将靶基因位点特异性整合到宿主的基因组中(17)。
[0014]基因组整合的基于T7的表达系统提供了显著的优势。与基于质粒的表达系统相比，在生产过程期间不存在质粒介导的代谢负荷和基因剂量的变化。然而，T7 RNA聚合酶(RNAP)在长期生产条件下容易发生突变。Striedner等人(17)在恒化器培养中证明了这一点，其中T7 RNAP的突变导致非生产细胞群更快生长，并且因此导致产物产量的大量损失。
[0015]因此，在本领域中显然需要改进的诱导型表达系统，其导致改进的表达率、低基础表达和在细胞水平上表达率的真正可调谐性，即使在低诱导物浓度下。

技术实现思路

[0016]本专利技术的目的是提供改进的诱导型系统，其具有改进的目的蛋白表达率控制和用于无质粒产生目的蛋白的非常低的基础表达。
[0017]本专利技术解决了所述问题。
[0018]根据本专利技术，提供了一种用于在原核宿主中产生目的蛋白的基于基因组的表达系统，所述表达系统至少包含
[0019]a)RNA聚合酶(RNAP)基因，
[0020]b)用于表达目的蛋白的基因，所述基因包含
[0021]‑
编码所述目的蛋白的编码序列，
[0022]‑
与所述编码序列可操作地连接的启动子，其中所述启动子被由a)表达的RNAP识别，和
[0023]‑
所述启动子序列内的至少一个lac操纵基因(lacO)；以及
[0024]c)用于表达lac阻遏蛋白(LacI)的lacI基因，所述lacI基因包含
[0025]‑
lacI编码序列，
[0026]‑
与所述lacI编码序列可操作地连接的lacI启动子，其中所述lacI启动子选自野生型lacI和增加lacI表达的lacI启动子；
[0027本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种用于在原核宿主中产生目的蛋白(POI)的基于基因组的表达系统，所述表达系统至少包含a)RNA聚合酶(RNAP)基因，b)编码POI的基因，所述基因包含
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编码序列，
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与所述编码序列可操作地连接的启动子，其中所述启动子被由a)表达的RNAP识别，和
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所述启动子序列内的至少一个lac操纵基因(lacO)；以及c)编码lac阻遏蛋白(LacI)的lacI基因，所述lacI基因包含
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编码序列，
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与所述lacI编码序列可操作地连接的lacI启动子，其中所述lacI启动子是野生型lacI启动子或增加LacI表达的lacI启动子；其中所述POI的表达率由结合LacI的诱导剂调节。2.根据权利要求1所述的基于基因组的表达系统，其中编码POI的所述基因含有(i)在所述启动子的序列内的一个lacO，或(ii)在所述启动子的序列内的一个lacO和在所述第一lacO上游的一个lacO。3.根据权利要求1或2所述的基于基因组的表达系统，其中编码POI的所述基因含有在所述启动子的序列内的一个lacO，并且所述lacI启动子是增加LacI表达的启动子。4.根据权利要求1至3中任一项所述的基于基因组的表达系统，其中编码POI的所述基因含有在所述启动子的序列内的一个lacO和在所述第一lacO上游的一个lacO，并且所述lacI启动子是增加LacI表达的启动子。5.根据权利要求1至4中任一项所述的基于基因组的表达系统，其中所述原核宿主是大肠杆菌(Escherichia coli/E.coli)，优选地所述宿主是大肠杆菌菌株BL21或K
‑
12。6.根据权利要求1至5中任一项所述的基于基因组的表达系统，其中所述RNAP是异源或同源RNAP，优选地所述RNAP是对所述宿主而言同源的RNAP，具体地其是大肠杆菌RNA聚合酶，优选σ
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大肠杆菌RNA聚合酶。7.根据权利要求1至6中任一项所述的基于基因组的表达系统，其中根据权利要求1所述的b)中的启动子选自T5、T5
N25
、T7A1、T7A2、T7A3、lac、lacUV5、tac和trc。8.根据权利要求1至7中任一项所述的基于基因组的表达系统，其中增加LacI表达的所述lacI启动子是包含SEQ ID NO:1的lacI
Q
启动子。9.根据权利要求1至8中任一项所述的基于基因组的表达系统，其中所述lac操纵基因是包含SEQ ID NO:3的lacO1、包含SEQ ID NO:4的lacO2或包含SEQ ID NO:5的lacO3或其具有至少65％序列同一性的功能变体或者完全对称的lacO。10.根据权利要求1至9中任一项所述的基于基因组的表达系统，其中与编码所述目的蛋白的编码序列可操作地连接的所述启动子包含初始转录序列(ITS)，优选包含SEQ ID NO:2的天然T7A1初始转录序列。11.根据权利...

【专利技术属性】
技术研发人员：A，
申请(专利权)人：勃林格殷格翰RCV两合公司，
类型：发明
国别省市：