一种重组EK酶工程菌的高密度发酵方法技术

本发明专利技术涉及生物发酵工程技术领域，尤其涉及一种重组EK酶工程菌的高密度发酵方法，具体包括：合成表达包含EK酶的重组融合蛋白的表达框序列，表达框序列如SEQ ID No.4所示，构建重组EK酶工程菌，菌种活化，高密度发酵培养，诱导表达EK酶。本发明专利技术的重组EK酶工程菌的高密度发酵方法，表达量可提高至19g/L以上，同时可显著降低包涵体蛋白的色素含量。降低包涵体蛋白的色素含量。

A high density fermentation method of recombinant EK enzyme engineering bacteria

【技术实现步骤摘要】
一种重组EK酶工程菌的高密度发酵方法


[0001]本专利技术涉及生物发酵工程
，尤其涉及一种重组EK酶工程菌的高密度发酵方法。

技术介绍

[0002]丝氨酸蛋白酶肠激酶（enterokinase）（简称肠激酶或EK酶），也被称为肠肽酶（enteropeptidase），是异源二聚体丝氨酸蛋白酶，一种催化胰蛋白酶原转变为活性胰蛋白酶的哺乳动物酶。肠激酶优先选择底物序列Asp
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Asp
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Asp
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Lys（DDDDK），并选择性地在赖氨酸之后切割。由于肠激酶的轻链结构在人、牛和猪中保守，其识底物别序列Asp
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Asp
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Asp
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Asp
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Lys在脊椎动物中也有很强的保守性，且几乎所有被定序的胰蛋白酶原都具有作用于4个天冬酰胺相连识别序列的特征，而此序列在其他的天然蛋白质上又非常罕见。肠激酶由1条结构亚基（重链）和1条催化亚基（轻链）构成，两者通过1个分子间二硫键结合，结构亚基负责将催化亚基固定在小肠刷状缘膜上并引导它向肠腔移动，催化亚基可以特异性识别Asp
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Asp
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Asp
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Asp
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Lys序列并沿序列的羧基端切下，将胰蛋白酶原活化为胰蛋白酶，从而启动各种酶原活化的级联。
[0003]对于外源基因的表达可以采用原核表达和真核表达系统进行，但真核表达系统在表达目的蛋白时存在一些缺陷。原核表达系统方面，大肠杆菌表达系统是研究最为深入，发展最迅速的表达系统，其遗传学背景、基因表达调控机理清晰，表达载体及宿主菌种类繁多，常被用于多肽和蛋白质的表达，是目前首选的外源表达系统。对于应用原核系统表达外源基因时，大多研究利用融合蛋白表达方式，将各种不同的引导肽序列融合到目的基因上，形成重组融合蛋白。在大肠杆菌中表达时，引导肽可以将目的蛋白分泌到细胞周质甚至细胞外，最后，通过蛋白酶等将引导肽切除去。在大肠杆菌（E.coli）中，许多哺乳动物蛋白被表达为融合蛋白，其必须被切割以释放成熟的活性蛋白。为了实现该目的，就需要有使用工具酶，优选直接在连接处切割而在产物上不留下额外氨基酸的工具酶。由于肠激酶的底物酶切位点序列具有上述高度的特异性，使得其成为基因工程融合蛋白表达后修饰过程中一个极其有用的工具酶而被广泛应用。
[0004]高密度培养一般指微生物在液体培养中细胞群体密度超过常规培养10倍以上时的生长状态或培养技术。现代高密度培养技术在用基因工程菌（尤其是大肠埃希氏菌）生产多肽类药物的实践中逐步发展。大肠埃希氏菌在生产各种多肽类药物中具有极其重要的地位。若能提高菌体培养密度，提高产物的比生产速率（单位体积单位时间内产物的产量），不仅可减少培养容器的体积、培养基的消耗和提高下游工程中分离、提取的效率，而且还可缩短生产周期、减少设备投入和降低生产成本。
[0005]但由于肠激酶自身氨基酸序列和结构特点，对于目前广泛应用的大肠杆菌表达系统获得的重组工程菌，其包涵体存在着蛋白表达量低、包涵体产物复性困难等的问题。因此，仍需要奖励能够更优的适应大肠杆菌的EK酶表达系统，构建具备更高的分泌表达和活性收率的重组肠激酶工程菌。
[0006]而且，在发酵方面，受制于现有发酵体系构建工程菌的表达效率低，材料损耗大，使产品的产量难以提升，同时伴随着产酶的成本居高不下。因此，开发一种重组EK酶工程菌的高密度发酵方法具有重大意义，以便于工业化生产EK酶。

技术实现思路

[0007]为了解决上述技术问题，本专利技术提供了一种重组EK酶工程菌的高密度发酵方法。
[0008]为了获得改善的EK蛋白的体外复性效率，提高EK蛋白的溶解性，保持蛋白酶的特异性和活性，进而能够提高收率，实现产业化应用价值的有效提升，本专利技术提出了一种突变的牛肠激酶，其相比现有商业化酶具备更优的酶活，且活性蛋白的收率可提高4倍以上。在此基础上，进一步获得了可以高效表达该牛肠激酶的重组EK酶工程菌。为了进一步提高产酶量，本专利技术进一步提出了该重组EK酶工程菌的高密度发酵方法，至少包括以下步骤：S1、构建重组EK酶工程菌，包括：合成表达包含EK酶的重组融合蛋白的表达框序列，表达框序列如SEQ ID No.4所示，将表达框序列插入到表达载体上，构建得到重组表达载体，并将重组表达载体导入到大肠杆菌中，得到重组EK酶工程菌，冻存备用；S2、菌种活化，得活化种子培养液；S3、发酵培养：将活化种子培养液接种至发酵培养基，发酵过程中，流加补料培养基；补料培养基的组成为：质量体积百分比为40%~ 70%的葡萄糖水溶液和质量体积百分比15% ~ 35%的酵母浸粉水溶液，按照1：3 ~ 6的体积比混合；S4、诱导表达：当OD 600值为145 ~160时，添加IPTG诱导EK酶的表达，至OD600值出现平台期发酵结束。
[0009]在本专利技术中，质量体积百分比（w/v）为1%的溶液是指1g溶质溶解于100 mL溶剂中。
[0010]具体的构建方式包括：设计牛肠激酶轻链蛋白突变体：在野生型牛肠激酶轻链基础上，在101、112、177位氨基酸发生突变，具体的突变为：K101P、C112T和A177K。上述突变体可改善蛋白的体外复性效率，提高蛋白本身的溶解性，保持蛋白酶的特异性和活性，进而能够提高收率，实现产业化应用价值的有效提升。
[0011]野生型牛肠激酶轻链（即EK酶）在变复性过程中稳定性差、复性率低、不利于纯化。而EK
L
m1是一种已商业化EK酶（雅心），其相对于野生型牛肠激酶轻链第112位半胱氨酸突变为苏氨酸，该突变使得EK
L
m1相较于野生型具备更好的复性率，该EK酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
[0012]虽然上述EK
L
m1相较于野生型具备更优的复性率，但碍于EK酶特点，其复性收率仍相对较低。为了获得改善的蛋白的体外复性效率，提高蛋白本身的溶解性，保持蛋白酶的特异性和活性，进而能够提高收率，实现产业化应用价值的有效提升，本专利技术设计了一种突变EK酶EKLm3，其相比现有商业化酶具备更优的酶活，且活性蛋白收率提高4倍以上。
[0013]本专利技术结合序列的保守性及三维空间结构分析，在野生型牛肠激酶轻链氨基酸序列的第101位引入脯氨酸残基，可以减少变性过程中聚集体的产生。在突变体EKLm1的氨基酸序列基础上将第101位赖氨酸突变为脯氨酸、第177位氨基酸突变为赖氨酸，得到突变体EKLm3，其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。
[0014]本专利技术具体的EK酶的氨基酸序列如下：(1)突变体EK
L
m1氨基酸序列SEQ ID No:1：IVGGSDSREGAWPWVVALYFDDQQVCGASLVSRDWLVSAAHCVYGRNMEPSKWKAVLGLHMASNLTSPQIETRLIDQIVINPHYNKRRKNNDIAMMHLEMKVNYTDYI本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种重组EK酶工程菌的高密度发酵方法，其特征在于，所述高密度发酵方法至少包括以下步骤：S1、构建重组EK酶工程菌，包括：合成表达包含EK酶的重组融合蛋白的表达框序列，所述表达框序列如SEQIDNo.4所示，将所述表达框序列插入到表达载体上，构建得到重组表达载体，并将所述重组表达载体导入到大肠杆菌中，得到所述重组EK酶工程菌，冻存备用；S2、菌种活化，得活化种子培养液；S3、发酵培养：将所述活化种子培养液接种至发酵培养基，发酵过程中，流加补料培养基；所述补料培养基的组成为：质量体积百分比为40%~70%的葡萄糖水溶液和质量体积百分比15%~35%的酵母浸粉水溶液，按照1：3~6的体积比混合；S4、诱导表达：当OD600值为145~160时，添加IPTG诱导EK酶的表达，至OD600值出现平台期发酵结束。2.根据权利要求1所述的高密度发酵方法，其特征在于，在步骤S1中，所述表达框序列插入到pET
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30a（+）的NdeI和XhoI酶切位点之间。3.根据权利要求1所述的高密度发酵方法，其特征在于，在S2中，所述菌种活化包括以下步骤：一级活化：取冻存的所述重组EK酶工程菌，按照1：800~1200的体积比，接种至活化培养基，35~38℃，200~240rpm，培养12~16小时，至菌种OD600值为4.0~8.0，得一级活化种子液；二级活化：将所述一级活化种子液按照1：4~6的体积比接种至活化培养基，35~38℃，200~240rpm，培养2~5小时，至菌种OD600值为3.0~4.0，得二级活化种子培养液。4.根据权利要求1所述的高密度发酵方法，其特征在于，在S3中，将所述S2中活化种子培养液按照1：5~15的体积比接种至发酵培养基；发酵条件为：温...

【专利技术属性】
技术研发人员：曹海燕，林兆生，连婕妮，王惠，朱志伟，辛瑞，
申请(专利权)人：吉林惠升生物制药有限公司，
类型：发明
国别省市：