钙蛋白酶-1在抵抗猪流行性腹泻病毒感染中的应用制造技术

本发明专利技术公开了钙蛋白酶

【技术实现步骤摘要】
钙蛋白酶
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1在抵抗猪流行性腹泻病毒感染中的应用


[0001]本专利技术属于生物工程领域，涉及猪小肠黏液蛋白钙蛋白酶
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1的应用，从猪小肠黏液 中筛选、分离和鉴定获得钙蛋白酶
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1能够显著抑制PEDV感染，钙蛋白酶
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1抗病毒的机 制在于其能够酶解PEDV S蛋白，抑制病毒入侵宿主细胞。

技术介绍

[0002]肠道黏膜构成了机体与外界接触的最大界面，是许多病原微生物侵入并建立感染的 重要部位。覆盖于肠上皮细胞表面的黏液层，对于维持猪小肠黏膜结构和功能的完整性 具有重要作用。黏液主要经肠道分泌型细胞，如杯状细胞、潘氏细胞等分泌形成，其成 分复杂，由水、黏蛋白、无机盐、抗菌肽以及一些小分子蛋白构成。除在消化过程中承 担润滑剂的作用以外，黏液在抵抗病原微生物的感染中同样也发挥着重要的作用，例如 小肠黏液中的黏蛋白2(Mucin 2，MUC2)能够形成粘稠的凝胶型网状结构，直接阻碍 病原微生物接触肠上皮细胞。除发挥物理屏障功能之外，黏液中还存在有大量的生物活 性成分，使其能直接灭活病原微生物，发挥主动防御功能。但受提取方法和分析手段的 限制，目前人们对黏液中具有保护活性物质认识仍十分有限，如何从黏液中有效筛选并 鉴定出具有抗病毒活性的成分，将为新型抗病毒药物或抗病毒饲料添加剂的制备提供有 效手段。
[0003]猪肠道冠状病毒主要感染哺乳仔猪的小肠(特别是新生仔猪)，并引起严重的胃肠 道症状，其中以猪流行性腹泻病毒(PEDV)的危害最大。研究表明极低含量的PEDV 就能导致仔猪发病，其感染后能造成小肠绒毛的大量脱落和广泛坏死，最终引起新生仔 猪的水样腹泻和脱水性死亡(死亡率高达100％)。目前，仍缺乏能为PEDV感染提供 有效肠道黏膜保护力的免疫策略，预防和控制PEDV的发生已成为世界上研究难题。在 此情况下，通过加固仔猪肠道黏膜屏障，直接阻断病毒经黏膜入侵，对于预防和控制 PEDV的发生具有重要的意义。作为肠道黏膜免疫的第一道防线，猪小肠黏液屏障在抵 抗PEDV感染中的潜在作用值得进一步探究。

技术实现思路

[0004]专利技术目的：本专利技术所要解决的技术问题是提供了一种从猪小肠黏液中纯化获得，具 有抵抗猪流行性腹泻病毒(PEDV)感染功能的黏液蛋白
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钙蛋白酶
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1。
[0005]本专利技术还要解决的技术问题是提供了表达盒、重组载体或细胞系，其含有所述的核 酸或基因。
[0006]本专利技术还要解决的技术问题是提供了一种重组蛋白表达细胞系。
[0007]本专利技术还要解决的技术问题是提供了一种重组钙蛋白酶
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1及其制备方法和应用。
[0008]本专利技术最后要解决的技术问题是提供了猪钙蛋白酶
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1、核酸或基因、表达盒、重组 载体或细胞系，重组钙蛋白酶
‑
1在制备预防或治疗猪流行性腹泻病毒相关疾病的药物或 饲料添加剂中的应用。
[0009]技术方案：本
技术实现思路
包括一种钙蛋白酶
‑
1，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。
[0010]本
技术实现思路
还包括核酸或基因，其编码所述的钙蛋白酶
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1，其核苷酸序列如SEQ IDNO：1所示。
[0011]本
技术实现思路
还包括表达盒、重组载体、细胞系或菌株，其含有所述的核酸或基因。
[0012]其中，所述重组载体是将所述的核酸或基因插入到真核表达载体中得到含有猪钙蛋 白酶
‑
1的基因的表达载体。其中，所述真核表达载体包括但不仅限于pCDNA3.4或 Ppic9K。
[0013]本
技术实现思路
还包括一种重组蛋白表达细胞系，所述细胞系是通过将所述的重组载体 转入宿主细胞后获得。所述细胞系包括但不仅限于哺乳动物细胞。
[0014]本
技术实现思路
还包括两种重组钙蛋白酶
‑
1，所述重组钙蛋白酶
‑
1是通过将所述的表达 载体转入细胞后表达、纯化获得。
[0015]其中，所述的猪钙蛋白酶
‑
1、所述的核酸或基因、所述的表达盒、重组载体、细胞 系或菌株在生产重组钙蛋白酶
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1中的应用。
[0016]本
技术实现思路
还包括两种重组钙蛋白酶
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1的制备方法，包括以下步骤：
[0017]1)编码钙蛋白酶
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1的基因的获得；
[0018]2)将编码钙蛋白酶
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1的基因导入载体中获得表达载体；
[0019]3)将表达载体转染细胞后进行纯化即得；
[0020]其中，所述细胞为293F细胞或酵母GS115。
[0021]其中，所述的猪钙蛋白酶
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1、所述的核酸或基因、所述的表达盒、重组载体或细胞 系在制备预防或治疗猪流行性腹泻病毒相关疾病的药物或饲料添加剂中的应用。
[0022]其中，所述应用通过体外裂解PEDV S1蛋白，体内保护仔猪免受PEDV感染而实 现。
[0023]有益效果：本专利技术首次通过分离纯化获得了猪钙蛋白酶
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1，并进一步获得了该酶的 核苷酸及氨基酸序列，通过实验研究发现，猪钙蛋白酶
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1具有较高的活性，而且进一步 进行重组钙蛋白酶
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1的制备以及应用。本专利技术的重组钙蛋白酶
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1具备较高的活性和显著 的抗PEDV病毒的功能，以及具有高裂解PEDV S1蛋白的活性。
附图说明
[0024]图1为小肠黏液总蛋白对PEDV感染的影响；(A)猪小肠黏液收集示意图；(B) CCK8试验测定黏液总蛋白的细胞毒性测定；(C)噬斑中和试验检测不同浓度小肠黏 液总蛋白的抗病毒作用；(D
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F)排查黏液总蛋白抵抗PEDV感染的具体阶段；(E) 空斑形成试验检测培养各组上清中的病毒滴度；(F)RT
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qPCR检测PEDV基因表达水 平。
[0025]图2为小肠黏液总蛋白中具有抗病毒活性蛋白的筛选鉴定。(A)用非变性胶分离 小肠黏液蛋白；采用Amicon超离过滤装置(截断量：100kDa)，将小肠黏液中小于100 kDa的蛋白通过非变性PAGE分离，收集为4个组分(I
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IV)；(B)空斑抑制试验测 定各蛋白组分的抗病毒活性；(C)排查蛋白组分III抑制PEDV感染的具体阶段；(D) 测定蛋白组分III处理后培养上清中(D)和细胞内(E)病毒含量，图中数字与图(C) 中各组编号对应。
[0026]图3为钙蛋白酶
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1介导黏液蛋白组分III的抗病毒作用。(A)通过SEC
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150凝胶 过滤柱收集黏液蛋白组分III的主峰，其分子量在70KD左右；(B
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D)纯化蛋白组分III 以一定的浓度梯度与PEDV孵育1h后，将混合物接种于Vero E6细胞。培养1h后，洗 去混本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种钙蛋白酶
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1，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。2.核酸或基因，其编码权利要求1所述的钙蛋白酶
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1，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。3.表达盒、重组载体或细胞系，其含有权利要求2所述的核酸或基因。4.根据权利要求3所述的重组载体，其特征在于，所述重组载体是将权利要求2所述的核酸或基因插入到真核表达载体中得到含有猪钙蛋白酶
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1的基因的表达载体。5.一种重组蛋白表达细胞系，其特征在于，所述细胞系是通过将权利要求4所述的重组载体转入宿主细胞后获得。6.一种重组钙蛋白酶
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1，其特征在于，所述重组钙蛋白酶
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1是通过将权利要求4所述的表达载体转入后表达、纯化获得。7.权利要求1所述的猪钙蛋白酶
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【专利技术属性】
技术研发人员：杨倩，李昱辰，王秀羽，张恩，
申请(专利权)人：南京农业大学，
类型：发明
国别省市：