高比活角蛋白酶突变体、毕赤酵母表达质粒的构建及菌株筛选和纯化方法技术

本发明专利技术涉及角蛋白酶突变体的序列及其分泌表达的酵母菌株Keratinase

【技术实现步骤摘要】
高比活角蛋白酶突变体、毕赤酵母表达质粒的构建及菌株筛选和纯化方法


[0001]本专利技术涉及酶基因功能改造
，具体涉及高比活角蛋白酶（Keratinase） 序列的确认、毕赤酵母表达载体的构建、分泌表达角蛋白酶的毕赤酵母菌株Keratinase
ꢀ‑
m/ pGAPZα
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A/GS115构建、构建结果及利用它来生产高活性角蛋白酶的纯化方法。

技术介绍

[0002]角蛋白酶( Keratinase) 是一种可以特异性降解角蛋白的酶类，由细菌、放线菌和真菌等多种微生物产生。角蛋白酶来源不同，其结构、理化性质、活性和底物也不同。这些酶大多数属于细胞外酶，个别为细胞内酶。根据角蛋白酶反应的最适 pH 值，可以把角蛋白酶分成酸性酶和碱性酶 2 类。不同的角蛋白酶有不同的特异性抑制剂，分别属于不同酶家族 的抑制剂，表明角蛋白酶具有不同的进化起源。以往对角蛋白酶的研究主要集中于菌种筛选、酶的提取纯化和活力测定等，对酶结构和基因表达的研究极少。
[0003]20 世纪 90 年代，随着分子生物学技术的发展，国外的一些学者开始进行角蛋白酶 基因工程表达和分子结构等方面的研究。角蛋白酶能使角蛋白降解为多肽和氨基酸，既可用于农业肥料的生产，又可作为畜禽的饲料蛋白源； 角蛋白酶是皮肤真菌重要的侵袭因子，其在皮肤病治疗方面的研究还有待于进一步挖掘。另外，角蛋白酶可“消化”导致疯牛病和人类克雅氏症的毒蛋白 ( Prion protein) ，从而可应用于医疗和实验仪器的净化；它还可用于皮革脱毛鞣制，配制润肤露、浴皂、洗发水和脱毛膏等美容品。而来自自然界细菌、放线菌和真菌等多种微生物产生的角蛋白酶，由于菌体内含量低，活性低，提取工艺复杂，生产成本高，至今无法大量生产，阻碍了角蛋白酶的推广使用。

技术实现思路

[0004]为解决上述技术问题，本专利技术提供一种高比活角蛋白酶突变体、毕赤酵母表达质粒的构建及菌株筛选和纯化方法。
[0005]本专利技术提供如下技术方案：我们选择重组表达的角蛋白酶是地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)分泌的，是一种丝氨酸蛋白酶，成熟的角蛋白酶含有243个氨基酸，比其前体少了136个氨基酸，分子量为24023道尔顿，pH值为6.21，整个氨基酸序列和胰蛋白酶家族的丝氨酸蛋白酶的氨基酸序列具有高度的相似性。根据对角蛋白酶分子结构及序列的分析，我们设计切除1
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127位及371
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379位的氨基酸序列，使功能区域更大范围地暴露，使之能够更好的和反应底物结合，从而提高酶的活性。并将第170位的苏氨酸(Thr)突变为缬氨酸（Val）,以保持分子结构的稳定性。
[0006]一种角蛋白酶突变体，角蛋白酶突变体的氨基酸序列为SEQ ID NO.1所示。
[0007]该序列的特点是只保留了成熟角蛋白酶序列中的功能区域和底物结合区（128~370位氨基酸）并将170位的苏氨酸点突变为缬氨酸，这种改变在理论上使功能区域更大范
围地暴露，使之能够更好的和反应底物结合，从而提高酶的活性。
[0008]同时，本专利技术采用毕赤酵母分泌表达系统，该系统产量高、生产成本低兼有真核表达系统翻译后修饰功能等优点，可以用于大量生产角蛋白酶，降低生产成本。
[0009]角蛋白酶毕赤酵母重组菌株的构建方法为：将修饰突变的角蛋白酶Keratinase基因插入pGAPZα
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A空载体的GAP启动子/α
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factor信号肽下游位点，并删除载体上的Kex2位点Lys
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Arg之后的Ste13位点Glu
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Ala
‑
Glu
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Ala,构建成角蛋白酶基因分泌型表达载体Keratinase
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m/ pGAPZα
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A；利用电转化的方法将Keratinase
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m/ pGAPZα
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A载体转化毕赤酵母（Pichia pastoris）的菌株GS115，构建成分泌型表达角蛋白酶突变体的毕赤酵母工程菌株Keratinase
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m/ pGAPZα
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A/GS115；通过抗生素筛选、SDS
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PAGE电泳分析及生物比活性测定，获得高表达高活性的角蛋白酶突变体毕赤酵母重组菌株。
[0010]上述的毕赤酵母重组菌株目标蛋白：角蛋白酶突变体（Keratinase
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m）的表达量达到451.6毫克/升，比活性为65.4国际单位/毫克；目标蛋白角蛋白酶突变体比天然的角蛋白酶比活性高5
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6倍，且具有很高的稳定性。
[0011]角蛋白酶突变体的纯化方法为：直接从分泌型角蛋白酶突变体毕赤酵母菌株Keratinase
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m/ pGAPZα
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A/GS115的发酵液中分离纯化角蛋白酶突变体：离心收集上清液，以氢氧化钠调节pH值，过阴离子交换层析柱，收集目标洗脱峰，得到纯度约65%的角蛋白酶突变体粗品，透析除盐，超滤浓缩，过分子筛层析柱，收集目标蛋白，得到纯度大于90%的角蛋白酶突变体蛋白。
[0012]与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：本专利技术采用基因工程表达的方法生产高活性的角蛋白酶突变体，比活性达到65.4国际单位/毫克,表达量达到451.6毫克/升蛋白，通过纯化可获得纯度达90%以上的目标蛋白角蛋白酶，为角蛋白酶今后的推广使用奠定良好基础。
附图说明
[0013]图1为角蛋白酶突变体（Keratinase
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m）表达载体构建图。
[0014]Keratinase
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m/ pGAPZα
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A表达载体分子大小为3.876kb。其中pGAPZα
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A为3.147kb，Keratinase
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m为732bp(包含终止子密码)；Keratinase
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m插入于载体pGAPZα
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A第747与824bp（XbaI位点）之间。
[0015]pGAPZα
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A载体结构为：磷酸甘油酸脱氢酶基因（GAP）启动子区域：第1
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483bp磷酸甘油酸脱氢酶基因启动子引物位点：第455
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476bpα
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交配因子分泌信号肽序列：第493
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759bpα
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交配因子分泌信号肽引物位点：第696
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716bp载体多克隆位点：第760
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828bpMyc抗原决定簇包：第827
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856bp3
’‑
乙醇氧化酶1基因引物位点：第974
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994bp乙醇氧化酶1转录终止区域：第593
‑
1233bp转录延伸因子1启动子区域本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种角蛋白酶突变体，其特征在于：角蛋白酶突变体的氨基酸序列为SEQ ID NO.1所示。2.一种角蛋白酶突变体表达载体，其特征在于：表达质粒中转入了权利要求1所述的角蛋白酶突变体基因。3.根据权利要求2所述的一种角蛋白酶突变体表达载体，其特征在于：表达质粒pGAPZα
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A。4.一种蛋白酶K突变体表达载体的构建，其特征在于：将修饰突变的角蛋白酶Keratinase基因插入pGAPZα
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A空载体的GAP启动子/α
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factor信号肽下游位点，并删除载体上的Kex2位点Lys
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Arg之后的Ste13位点Glu
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Ala
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Glu
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Ala,构建成角蛋白酶基因分泌型表达载体Keratinase

【专利技术属性】
技术研发人员：王玉玲，李大可，温林海，
申请(专利权)人：河南合智医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：