适用于地衣芽胞杆菌表达的碱性蛋白酶基因序列及应用制造技术

本发明专利技术属于酶的基因工程技术领域，具体涉及一种新的高效表达碱性蛋白酶的地衣芽胞杆菌工程菌株的构建及应用。本发明专利技术通过对克劳氏芽胞杆菌（Bacillus clausii）来源的碱性蛋白酶进行改造和筛选，获得了适用于地衣芽胞杆菌表达的碱性蛋白酶基因，所述基因为SEQ ID NO.7所示。将该基因在地衣芽胞杆菌BL10中进行表达，使用国标法检测，构得的地衣芽胞杆菌工程菌株的蛋白酶酶活力，该突变株的碱性蛋白酶酶活力达到29114.85 U/mL，相比原始的碱性蛋白酶生产株的酶活提高了19.41%，本发明专利技术促进了碱性蛋白酶应用水平的提高。碱性蛋白酶应用水平的提高。

【技术实现步骤摘要】
适用于地衣芽胞杆菌表达的碱性蛋白酶基因序列及应用


[0001]本专利技术属于酶的基因工程
，具体涉及高效表达碱性蛋白酶的地衣芽胞杆菌工程菌株及其构建方法与应用。

技术介绍

[0002]碱性蛋白酶(alkaline protease)是指在pH偏碱性(9
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11)范围内水解蛋白质肽键的内肽酶，属于丝氨酸蛋白水解酶类，分子大小在27kD左右。碱性蛋白酶是在工业用酶中占据的比例最大，主要用作加酶洗涤剂，也在食品、医疗、酿造、丝绸等行业有广泛应用。
[0003]当前碱性蛋白酶在蛋白体系中表达水平逐渐成熟，并正处于瓶颈期，急需从多种角度创新突破，构建高效表达碱性蛋白酶的地衣芽胞杆菌工程菌株。碱性蛋白酶在外源蛋白表达体系中表达的基因序列，大多未经过密码子优化工作，便直接用于蛋白表达生产。而目的蛋白的来源菌株与蛋白表达体系的GC含量不尽相同，编码相同氨基酸所使用的密码子的比例也有一定差异，蛋白表达体系中的某些含量较低的密码子可能成为限制目的蛋白翻译和高效表达的重要因素。虽然密码子的优化是本领域的常规技术，但优化本身也存在不确定性，目前的优化多借助相关软件辅助分析完成，通常直接使用最优密码子完成替换过程，其往往并不能最终获得更好的产量提高。有研究表明，密码子的随机化处理(Menzella,2011)、非最优密码子的使用(Zhou,2013)会显著影响蛋白质的结构和功能。因此，进行基因的密码子优化，需要进一步综合考虑目的基因的翻译速率和空间结构、二级结构等因素的复杂关系，往往需要根据经验甚至是运气达到优化的目的。此外，单因素的改变对终目标产生的影响较小，多因素的叠加有助于获得更理想的效果。由于各单因素并非彼此独立，叠加效果也并不总能达到“1+1＝2”的效果。突变位点的个数和顺序的不同组合，将助力筛选到更有实际提升效果的优异突变体。
[0004]Menzella HG.Comparison of two codon optimization strategies to enhance recombinant protein production in Escherichia coli.Microb Cell Fact.2011；10:15.Published 2011Mar 3.doi:10.1186/1475
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2859
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10
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15.
[0005]Zhou M,Guo J,Cha J,et al.Non
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optimal codon usage affects expression,structure and function of clock protein FRQ.Nature.2013；495(7439):111
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115.doi:10.1038/nature11833.

技术实现思路

[0006]适用于地衣芽胞杆菌表达的碱性蛋白酶基因，所述基因为SEQ ID NO.7所示。
[0007]适用于地衣芽胞杆菌表达的碱性蛋白酶基因在制备碱性蛋白酶中的应用。将本专利技术提供的基因在地衣芽胞杆菌中进行表达，相比原始的碱性蛋白酶生产株的酶活提高了19.41％。
[0008]为了达到上述目的，本专利技术采取了以下措施：
[0009]适用于地衣芽胞杆菌表达的碱性蛋白酶基因，所述基因为SEQ ID NO.7所示。
[0010]适用于地衣芽胞杆菌表达的碱性蛋白酶基因在制备碱性蛋白酶中的应用，是将SEQ ID NO.7所示基因在地衣芽胞杆菌中进行表达。
[0011]以上所述的应用中，优选的，目前报道的地衣芽胞杆菌均可用于本专利技术，优选的，碱性蛋白酶的表达宿主为地衣芽胞杆菌BL10(CN104630123A，CCTCC NO：M2013400)。
[0012]以上所述的应用中，优选的，将SEQ ID NO.7所示基因在地衣芽胞杆菌中进行表达时，表达载体为pHY300PLK。
[0013]与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：
[0014]克劳氏芽胞杆菌和地衣芽胞杆菌的导致碱性蛋白酶在地衣芽胞杆菌中表达受限，本专利技术通过基因突变，对密码子进行替换，并将有利突变位点进行不同的叠加组合，将组合后的碱性蛋白酶基因转入地衣芽胞杆菌工程菌株BL10后，酶活达到29114.85U/mL，相比原始的碱性蛋白酶生产株的酶活提高了19.41％，本专利技术促进了碱性蛋白酶应用水平的提高。
附图说明
[0015]图1碱性蛋白酶含有的地衣芽胞杆菌差异密码子的种类与位置示意图；
[0016]差异密码子已突出显示。
[0017]图2本专利技术的碱性蛋白酶突变菌株的PCR扩增电泳图
[0018]泳道1
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3为BL10/aprE，泳道4
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6为BL10/aprE
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L14，泳道6
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9为BL10/aprE
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P87，泳道10
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12为BL10/aprE
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P97，泳道13
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15为BL10/aprE
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P116，泳道16
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18为BL10/aprE
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P125，泳道19
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21为BL10/aprE
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P150，泳道22
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24为BL10/aprE
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P125，泳道25
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27为BL10/aprE
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P150，泳道28
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30为BL10/aprE
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P162、泳道31
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32为BL10/aprE
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P165，泳道32
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34为BL10/aprE
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L199，泳道35为BL10/aprE
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P240，泳道36为BL10/aprE
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P306，泳道37为BL10/aprE
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P315，泳道38为BL10/aprE
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P344，泳道39为BL10/aprE
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L355。目的大小均为2333bp。
[0019]图3为不同突变体发酵后得到的碱性蛋白酶酶活。
[0020]图4为有利突变位点的叠加表达菌株的碱性蛋白酶酶活示意图。
[0021]图5为有利突变位点的叠加表达菌株的PAGE电泳
[0022]泳道1、2为对照BL10/aprE，泳道3、4为叠加突变菌株BL10/aprE
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L14
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L199
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L355。
具体实施方式：
[0023]下面结合实施例对本专利技术的
技术实现思路
做进一步说明，但本专利技术不只限于这些实施例，不能以下述实施例来限定本专利技术的保护范围。
[0024]实施例1：
[0025本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.适用于地衣芽胞杆菌表达的碱性蛋白酶基因，所述基因为SEQ ID NO.7所示。2.权利要求1所述的基因在地衣芽胞杆菌发酵生产碱性蛋白酶中的应用。3.根据权利要求2所述的应用...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈守文，张清，贺诗思，朱婉莹，蔡冬波，
申请(专利权)人：湖北大学，
类型：发明
国别省市：