一种高活性和高热稳定性的纳豆激酶突变体制造技术

本发明专利技术公开了一种高活性和高热稳定性的纳豆激酶突变体，属于蛋白质工程领域。本发明专利技术筛选得到三种纳豆激酶突变体，分别是突变体M2(S62AN181DY217KN218SN259P)，突变体M3(P57CA92C)以及突变体M4(S62AP57CA92CN181DY217KN218SN259P)。其中突变体M4在55℃与65℃下半衰期分别较野生型提升了20.7倍与12.9倍，这是目前已有的报道中关于纳豆激酶热稳定性最优的突变体，同时比酶活也较野生型提升了2.1倍。本发明专利技术实现了在提升纳豆激酶热稳定性的同时保持其催化活性，以突破“稳定性活性的权衡”，为纳豆激酶工业化应用奠定了基础。奠定了基础。奠定了基础。

【技术实现步骤摘要】
一种高活性和高热稳定性的纳豆激酶突变体


[0001]本专利技术涉及一种高活性和高热稳定性的纳豆激酶突变体，属于蛋白质工程领域。

技术介绍

[0002]纳豆激酶(Natto Kinase，NK)是枯草杆菌蛋白酶家族的一种依赖钙离子的丝氨酸蛋白酶，作为一种高效的纤溶酶在血栓治疗和食品工业中具有潜在的应用前景。然而，纳豆激酶和其他嗜中性枯草杆菌丝氨酸蛋白酶一样，在30℃
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50℃具有广泛的活性，但在55℃以上由于不可逆的自溶而迅速失活，这给工业领域的纯化和催化带来了困难。因此，热稳定性更高的纳豆激酶的开发将增加生物催化剂在医药和食品工业生产中的应用。针对这一问题，许多研究者通过在纳豆激酶氨基酸序列中突变相应的氨基酸以引入氢键，二硫键，离子键等相互作用，以提升纳豆激酶的热稳定性。但是，在前期的针对纳豆激酶的改造的研究中都会存在这样一个问题：即提升热稳定性的同时纳豆激酶对应的催化效率就会降低，反之，提升催化效率的同时对应的热稳定性就会降低，这一“稳定性
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活性的权衡”使得纳豆激酶的改造面临较大的困难。

技术实现思路

[0003]为了解决上述问题，本专利技术通过对氨基酸序列如SEQ ID NO.1的纳豆激酶进行定点突变，以筛选获得一系列纳豆激酶突变体。
[0004]本专利技术的第一个目的是提供一种兼具高活性与高热稳定性的纳豆激酶突变体，所述纳豆激酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.2～SEQ ID NO.4所示。
[0005]本专利技术的第二个目的是提供一种编码上述纳豆激酶突变体的基因。
[0006]本专利技术的第三个目的是提供一种携带上述基因的重组载体。
[0007]本专利技术的第四个目的是提供一种携带上述基因，或上述重组载体的微生物细胞。
[0008]在本专利技术的一种实施方式中，所述微生物细胞以细菌或真菌为表达宿主。
[0009]在本专利技术的一种实施方式中，所述微生物细胞以枯草芽孢杆菌或大肠杆菌为表达宿主。
[0010]在本专利技术的一种实施方式中，所述微生物细胞以枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis ComK为宿主。
[0011]本专利技术的第五个目的是提供一种重组菌，所述重组菌表达上述纳豆激酶突变体，以穿梭质粒pBP43
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pro
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ter为表达载体，以枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis ComK为宿主。
[0012]本专利技术还提供上述纳豆激酶突变体，或上述基因，或上述重组载体，或上述微生物细胞，或上述重组菌在医药、食品领域的的应用。
[0013]本专利技术还提供上述纳豆激酶突变体，或上述基因，或上述重组载体，或上述微生物细胞，或上述重组菌在制备治疗、预防和/或缓解心血管疾病的药物中的应用。
[0014]本专利技术还提供上述纳豆激酶突变体，或上述基因，或上述重组载体，或上述微生物
细胞，或上述重组菌在制备预防和/或缓解心血管疾病的食品中的应用。
[0015]有益效果：
[0016]1、本专利技术针对纳豆激酶的22个氨基酸位点进行定点突变，并根据比酶活高于野生酶，65℃处理30min残余酶活高于60％筛选得到7个突变体S62A、P57C、A92C、N181D、Y217K、N218S和N259P。
[0017]2、将筛选到的7个突变位点进行组合突变，获得高热稳定性突变体M2(S62AN181DY217KN218SN259P)，高活性突变体M3(P57CA92C)以及兼具高活性与高热稳定性突变体M4(S62AP57CA92CN181DY217KN218SN259P)。其中突变体M4纯化后在55℃与65℃下半衰期分别较野生型提升了20.7倍与12.9倍，这是目前已有的报道中关于纳豆激酶热稳定性最优的突变体，同时比酶活也较野生型提升了2.1倍。本专利技术实现了在提升纳豆激酶热稳定性的同时保持其催化活性，以突破“稳定性活性的权衡”，为纳豆激酶工业化应用奠定了基础。
附图说明
[0018]图1：野生型，M2，M3，M4在55℃与65℃下半衰期。
[0019]图2：野生型，M2，M3，M4比酶活。
[0020]图3：纯酶的SDS
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PAGE电泳图，M：蛋白Marker；1：野生型(WT)；2：突变体M2；3：突变体M3；4：突变体M4。
具体实施方式
[0021]培养基：
[0022]LB培养基(1L)：胰蛋白胨10g，NaCl 10g，酵母提取物5g，pH 7.0，配制固体培养基时添加琼脂粉20g。
[0023]TB培养基(1L)：胰蛋白胨12g，酵母提取物24g，KH2PO42.31g，K2HPO412.54g，甘油4g。
[0024]缓冲液：
[0025]柱平衡缓冲液：20mM
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Tris
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HCl,pH 8.1
[0026]洗脱缓冲液：20mM
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Tris
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HCl,0.5M NaCl,pH 8.1。
[0027]质粒与宿主：
[0028]采用穿梭质粒pBP43
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ter为载体构建各突变体，以E.coli JM109为克隆宿主构建质粒，以Bacillussubtilis ComK为表达宿主进行各突变体质粒表达验证。
[0029]Bacillus subtilis ComK：已公开于文章https://doi.org/10.1186/s12934
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1148
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3中。
[0030]pBP43
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ter：已公开于文章https://doi.org/10.1186/s12934
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3中。
[0031]实施例1：突变体质粒构建
[0032]根据本实验室已有的含有纳豆激酶野生型序列的穿梭质粒pBP43
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ter，以全质粒PCR的方法构建单点突变体。突变序列设计在上游引物同源臂上，通过全质粒PCR方法扩增得到单点突变体质粒，相应单点突变位点的引物见表1。
[0033]根据本实验室已有的含有纳豆激酶野生型序列的穿梭质粒pBP43
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ter，以组装的方法构建双点突变体质粒，以PCR方法分别构建质粒骨架片段与目的片段。质粒骨架PCR反应条件同单点突变的条件，相应双点突变位点的引本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种纳豆激酶突变体，其特征在于，所述纳豆激酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.2～SEQ ID NO.4所示。2.编码权利要求1所述纳豆激酶突变体的基因。3.携带权利要求2所述基因的重组载体。4.携带权利要求2所述基因，或权利要求3所述重组载体的微生物细胞。5.如权利要求4所述的微生物细胞，其特征在于，所述微生物细胞以细菌或真菌为表达宿主。6.如权利要求5所述的微生物细胞，其特征在于，所述微生物细胞以枯草芽孢杆菌或大肠杆菌为表达宿主。7.一种重组菌，其特征在于，所述重组菌表达权利要求1所述纳豆激酶突变体，以穿梭质粒pBP43
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NK
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【专利技术属性】
技术研发人员：周哲敏，罗杰，韩来闯，崔文璟，程中一，刘中美，周丽，郭军玲，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：