源自鲎的重组G因子及使用该重组G因子的β-葡聚糖的测定方法技术

本发明专利技术的课题在于提供被β

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】源自鲎的重组G因子及使用该重组G因子的
β
‑
葡聚糖的测定方法


[0001]本专利技术涉及一种由源自鲎的新型的G因子α亚基和G因子β亚基组成的异源二聚体、使用该异源二聚体的β
‑
葡聚糖(以下，缩写为“BG”。)的测定方法及包含该异源二聚体的试剂盒。

技术介绍

[0002]在内脏、血液系统及淋巴系统中产生的深部真菌病为抵抗力减弱的状态，例如免疫缺陷状态的患者罹患的机会性感染的一种，患者往往会成为极其严重的病情。作为深部真菌病的病原体菌的代表例，可以举出念珠菌、曲霉菌，在其任何一种的细胞壁中都共同存在BG。因此，检测并测定血中BG是有用的。在临床诊断领域中，血浆或血清中BG的浓度被用作深部真菌感染病的早期诊断、治疗效果及预后判定的指标。
[0003]BG为以β(1
→
3)键合的葡萄糖重复结构为主链的多糖，是几千～100万左右的高分子量的物质。也存在具有(1
→
6)键合或(1
→
4)键合的支链的情况。在鲎的血细胞提取物(变形细胞裂解液、Amebocyte Lysate，以下，缩写为“裂解液”。)中存在作为由G因子α亚基和G因子β亚基构成的异源二聚体的G因子。BG具有与G因子α亚基的BG结合结构域(domain)部分结合的性质。
[0004]作为测定BG的方法，例如已知有如下所述的合成底物法，其利用上述裂解液中的G因子介导的反应途径并使用合成肽底物。
[0005]若BG与G因子α亚基的BG结合结构域部分结合，则G因子成为具有蛋白酶活性的活性G因子。活性G因子通过其蛋白酶活性而使存在于裂解液中的凝固酶原(Proclotting enzyme)转化为凝固酶(Clotting enzyme)(非专利文献1)。凝固酶将合成肽底物(例如Boc
‑
DEL
‑
pNA)的合成底物进行酰胺水解而使pNA游离。因此，通过测定生成的显色物质(pNA)的吸光度，能够将BG进行定量。
[0006]源自中华鲎属鲎(Tachypleus tridentatus)的G因子α亚基及β亚基已被克隆(非专利文献2、专利文献1)。
[0007]在专利文献2中，使用非专利文献2及专利文献1中所记载的G因子，在未添加BG的状态下测定蛋白酶活性。
[0008]现有技术文献
[0009]专利文献
[0010]专利文献1：日本专利第4832134号公报
[0011]专利文献2：国际公开第WO2008/004674号小册子
[0012]非专利文献
[0013]非专利文献1：T.Morita et al.,FEBS Lett.,1981,vol.129,p.318
‑
321
[0014]非专利文献2：N.Seki et al.,J.Biol.Chem.,1994,vol.269,No.2,p.1370
‑
1374

技术实现思路

[0015]专利技术要解决的技术课题
[0016]专利文献1、专利文献2等中所记载的技术使用非专利文献2中所确定的基因序列来进行，其使用昆虫细胞培养培养基。然而，已知在昆虫细胞培养培养基中存在来自酵母提取液的BG污染。并且，在专利文献1中，没有在未添加BG的状态下测定蛋白酶活性的试验。因此，在专利文献1中所制作的源自中华鲎属鲎的G因子是否被BG特异性激活是不明确的。
[0017]实际上，根据由本专利技术人等使用将BG设为检测限以下的培养基进行的验证，如由后述的实施例1的结果明确可知，利用非专利文献2及专利文献2中所记载的方法制作的源自中华鲎属鲎的重组G因子即使存在BG，也无法确认蛋白酶活性。即，使用这些文献中所记载的DNA序列，难以制作转化为在BG的存在下具有蛋白酶活性的活性G因子的G因子(前体)。
[0018]此外，在专利文献3中记载有以几ng量级的检测灵敏度测定出了BG。然而，在临床诊断上，在血浆或血清中BG的测定中要求以几pg量级进行测定，因此几ng量级的检测灵敏度不具有足以用于临床诊断的性能。
[0019]鉴于上述状况，本专利技术的课题在于提供被BG依赖性激活的源自鲎的G因子及使用该G因子的高灵敏度的BG的测定方法。
[0020]用于解决技术课题的手段
[0021]本专利技术是为了解决上述课题而完成的，其由以下构成组成。
[0022][1]一种异源二聚体，其为含有与序列号2或序列号4表示的氨基酸序列相同或实质上相同的氨基酸序列的G因子α亚基和含有与序列号6、8、10、12、14或16中的任一个表示的氨基酸序列相同或实质上相同的氨基酸序列的G因子β亚基的组合。
[0023][2]根据所述[1]所述的异源二聚体，其选自下述异源二聚体：
[0024](i)含有序列号2表示的氨基酸序列的G因子α亚基和含有序列号6表示的氨基酸序列的G因子β亚基的组合的异源二聚体；
[0025](ii)含有序列号2表示的氨基酸序列的G因子α亚基和含有序列号8表示的氨基酸序列的G因子β亚基的组合的异源二聚体；
[0026](iii)含有序列号2表示的氨基酸序列的G因子α亚基和含有序列号12表示的氨基酸序列的G因子β亚基的组合的异源二聚体；
[0027](iv)含有序列号2表示的氨基酸序列的G因子α亚基和含有序列号14表示的氨基酸序列的G因子β亚基的组合的异源二聚体；
[0028](v)含有序列号4表示的氨基酸序列的G因子α亚基和含有序列号10表示的氨基酸序列的G因子β亚基的组合的异源二聚体；
[0029](vi)含有序列号4表示的氨基酸序列的G因子α亚基和含有序列号16表示的氨基酸序列的G因子β亚基的异源二聚体。
[0030][3]根据所述[2]所述的异源二聚体，其选自(i)、(ii)或(v)。
[0031][4]一种β
‑
葡聚糖的测定方法，其使用试样以及含有序列号2或序列号4表示的氨基酸序列的G因子α亚基和含有与序列号6、8、10、12、14或16中的任一个表示的氨基酸序列相同或实质上相同的氨基酸序列的G因子β亚基的组合的异源二聚体。
[0032][5]一种G因子α亚基，其含有序列号2或序列号4表示的氨基酸序列。
[0033][6]一种G因子β亚基，其含有与序列号6、8、10、12、14或16中的任一个表示的氨基
酸序列相同或实质上相同的氨基酸序列。
[0034][7]一种β
‑
葡聚糖测定用试剂盒，其包含异源二聚体，该异源二聚体含有与序列号2或序列号4表示的氨基酸序列相同或实质上相同的氨基酸序列的G因子α亚基和含有与序列号6、8、10、12、14或16中的任一个表示的氨基酸序列相同或实质上相同的氨基酸序列的G因子β亚基的组合。
[0035]并且，本专利技术可以包括以下构成。
[0036][8]一种载体，其整合有具有编码与序列号2、4、6、8、1本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种异源二聚体，其为含有与序列号2或序列号4表示的氨基酸序列相同或实质上相同的氨基酸序列的G因子α亚基和含有与序列号6、8、10、12、14或16中的任一个表示的氨基酸序列相同或实质上相同的氨基酸序列的G因子β亚基的组合。2.根据权利要求1所述的异源二聚体，其选自下述异源二聚体：(1)含有序列号2表示的氨基酸序列的G因子α亚基和含有序列号6表示的氨基酸序列的G因子β亚基的组合的异源二聚体；(2)含有序列号2表示的氨基酸序列的G因子α亚基和含有序列号8表示的氨基酸序列的G因子β亚基的组合的异源二聚体；(3)含有序列号2表示的氨基酸序列的G因子α亚基和含有序列号12表示的氨基酸序列的G因子β亚基的组合的异源二聚体；(4)含有序列号2表示的氨基酸序列的G因子α亚基和含有序列号14表示的氨基酸序列的G因子β亚基的组合的异源二聚体；(5)含有序列号4表示的氨基酸序列的G因子α亚基和含有序列号10表示的氨基酸序列的G因子β亚基的组合的异源二聚体；(6)含有序列号4表示的氨基酸序列的G...

【专利技术属性】
技术研发人员：山本阳太郎，北川刚史，福地大树，
申请(专利权)人：富士胶片株式会社，
类型：发明
国别省市：