【技术实现步骤摘要】
一种乳腺癌模型猪的构建方法及应用
[0001]本专利技术涉及基因编辑
，具体涉及一种采用CRISPR/Cas9系统及同源重组技术构建的在基因组中的特定位置整合并由乳腺特异性启动子MMTV
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LTR驱动表达PyMT致癌基因的猪重组细胞，该重组猪细胞被用于克隆生产乳腺癌模型猪，该模型猪可用于下一步的药物筛选及药效评价、基因及细胞治疗、乳腺癌发病机制的研究等生物医药领域。
技术介绍
[0002]根据世界卫生组织国际癌症研究机构(IARC)发布的2020年全球最新癌症负担数据显示，2020年内新增癌症病例60％来自于最常见的10种肿瘤，其中女性乳腺癌占11.7％，在数量上首次超越了肺癌(11.4％)，成为全球诊断人数最多的癌症。女性乳腺癌第一次成为最常被诊断出的癌症，是威胁女性健康的第一杀手，也成为了当今最紧迫的健康问题之一。随着现代医疗的不断发展，尽管在癌症诊断、治疗和寿命方面有了进步，但对死亡率的改善程度一直不大。缺乏对疾病自然史的了解是造成这种局限性的主要原因，目前在分子水平上还不清楚乳腺肿瘤中哪些变化...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种表达PyMT的猪细胞，其特征在于，将编码PyMT的核苷酸序列插入猪安全港位点，获得表达SEQ ID NO：14所示的PyMT的猪细胞，所述的猪安全港位点选自猪ROSA26、AAVS1、H11或COL1A1安全港位点。2.根据权利要求1所述的猪细胞，其特征在于，所述的插入的编码PyMT的核苷酸序列如SEQ ID NO：39所示。3.根据权利要求1或2所述的猪细胞，其特征在于，ROSA26安全港位点区域及其上下游各500bp的核苷酸序列如SEQ ID NO：40所示，AAVS1安全港位点区域及其上下游各500bp的核苷酸序列如SEQ ID NO：41所示，H11安全港位点区域及其上下游各500bp的核苷酸序列如SEQ ID NO：42所示，COL1A1安全港位点区域及其上下游各500bp的核苷酸序列如SEQ ID NO：43所示。4.根据权利要求1
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3任一所述的猪细胞，其特征在于，所述的编码PyMT的核苷酸序列在猪细胞中通过外源启动子调控，所述的外源启动子为MMTV
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LTR，优选的，所述的MMTV
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LTR的核苷酸序列如SEQ ID NO：15所示。5.根据权利要求1
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4任一所述的猪细胞，其特征在于，所述的猪细胞为猪成纤维细胞或乳腺细胞。6.一种权利要求1
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5任一所述的猪细胞的构建方法，其特征在于，使用安全港位点载体将编码PyMT的核苷酸序列插入猪安全港位点，所述的安全港位点载体包含编码PyMT的核苷酸序列和安全港位点载体骨架，所述的安全港位点载体骨架包含安全港插入位点的5
’
同源臂和3
’
同源臂，所述的编码PyMT的核苷酸序列位于5
’
同源臂与3
’
同源臂之间，所述的安全港位点载体骨架选自下列任一项所示：A)ROSA26安全港位点载体骨架，其5
’
同源臂如SEQ ID NO：5所示，3
’
同源臂如SEQ ID NO：6所示；B)AAVS1安全港位点载体骨架，其5
’
同源臂如SEQ ID NO：7所示，3
’
同源臂如SEQ ID NO：8所示；C)H11安全港位点载体骨架，其5
’
同源臂如SEQ ID NO：9所示，3
’
同源臂如SEQ ID NO：10所示；或D)COL1A1安全港位点载体骨架，其5
’
同源臂如SEQ ID NO：11所示，3
’
同源臂如SEQ ID NO：12所示。7.根据权利要求6所述的构建方法，其特征在于，使用sgRNA载体进行猪细胞的构建，所述的sgRNA载体包含靶向ROSA26、AAVS1、H11或COL1A1安全港位点的sgRNA，其中：靶向ROSA26的sgRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO：21所示，靶向AAVS1的sgRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO：22所示，靶向H11的sgRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO：23所示，靶向COL1A1的sgRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO：24所示。8.根据权利要求6或7所述的构建方法，其特征在于，使用Cas载体进行猪细胞的构建，所述的Cas载体包含编码Cas蛋白、EGFP和Puro抗性蛋白的核苷酸序列，其中，所述的Cas蛋白选自Casl、CaslB、Cas2、Cas3、Cas4...
【专利技术属性】
技术研发人员：牛冬，汪滔，陶裴裴，曾为俊，王磊，程锐，黄彩云，赵泽英，马翔，段星，刘璐，
申请(专利权)人：南京启真基因工程有限公司，
类型：发明
国别省市：
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