4-1BB报告基因293T稳转细胞株构建和应用制造技术

本发明专利技术公开了一种4

【技术实现步骤摘要】
4
‑
1BB报告基因293T稳转细胞株构建和应用


[0001]本专利技术涉及生物医药
，具体涉及一种4
‑
1BB报告基因293T稳转细胞株构建和应用；并利用该细胞株进行CD137受体激动剂活性测定的方法本专利技术进一步涉及到CD137受体激动剂的中和抗体的检测方法。

技术介绍

[0002]4‑
1BB(UniProt ID：Q07011)是肿瘤坏死因子配体超家族成员9(4
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1BBL)的受体，属于单次跨膜蛋白。4
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1BB受体和其配体在调节人体的免疫应答中发挥了关键的作用。4
‑
1BB受体为激动诱导型共刺激分子，4
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1BB受体激活通过细胞毒T细胞发挥抗肿瘤活性的功能。4
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1BBL结合细胞膜上的4
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1BB后通过募集TRAF1和TRAF2，激活胞内的信号通路，进一步激活NF
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κB,AKT,p38MAPK和ERK信号通路。
[0003]在肿瘤免疫治疗药物研发过程，靶向4
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1BB的激动调节剂是目前研发的热点。目前尚未有靶向4
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1BB的药物上市，处于临床研发阶段的4
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1BB的激动剂包括Urelumab(BMS
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663513),Utomilumab(PF
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05082566)，LVGN
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6051，ADG
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106和ES101等十多个品中，其中有单抗，也有双特异抗体。靶向4
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1BB的药物研发前景广阔，竞争激烈，4
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1BB激动剂的生物学分析方法(包括活性测试方法，和中和抗体检测方法)是靶向4
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1BB药物研发重要的工具，有着极大的市场应用场景。
[0004]现有的技术存在以下缺点：生物治疗药物的研发主要包括药物发现，临床前和临床研究，商业化生产三个大的阶段。在药物发现和商业化生产过程中，药物相对于靶点的生物学活性测定是必不可少的过程。通常情况下采用重组表达技术可以将4
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1BB受体蛋白重组表达出来，通过4
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1BB候选药物和4
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1BB受体蛋白的结合活性实验利用ELISA技术来判断药物的生物学活性。天然状态下4
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1BB在细胞膜表面的存在形式为同源三聚的状态，候选药物和4
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1BB在蛋白水平的结合并不一定能够激活4
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1BB受体启动下游的信号通路，有文献记载只有在候选药物结合细胞膜表面的4
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1BB受体且使其在细胞膜表面多聚时才会激活胞内的信号通路发挥生理学功能。在真实的生理环境下，细胞毒T细胞表面的4
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1BB能够被候选药物激活，从而发挥T细胞杀伤的作用，如果测试其功能活性需要采集全血或者分离PBMC和候选药物孵育，使用流式技术测试T细胞的增殖检测或者测试孵育上清的细胞因子释放。以配体受体结合原理为基础的ELISA方法进行4
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1BB候选药物的活性测定，只是测定了候选药物和靶点4
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1BB受体的结合活性，并不能表征其功能活性。使用全血或者PBMC进行功能活性表征，检测过程较为繁琐，且全血或者PBMC的个体差异较大，批次差异较大，方法的稳定性不佳。以4
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1BB报告基因293T稳转细胞株为关键的试剂，进行细胞水平的候选药物活性测试能够表征候选药物的功能学活性的同时，方法的稳定性非常优秀，是比较合适的4
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1BB候选药物的活性测定方法。
[0005]在临床前和临床研究中，抗药抗体和中和抗体的检测是评估药物安全性和有效性必不可少的步骤。中和抗体(NAb)测定方法的平台主要可分为基于细胞的，和基于非细胞的。由于细胞学方法和药物体内环境的生理学更佳的相关性，EMA，FDA和CFDA免疫原性测定
的指导原则文件均表现出其对于细胞学中和抗体检测的偏好性。以4
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1BB报告基因293T稳转细胞株为关键的试剂，进行细胞水平的候选药物的中和抗体检测相对于配体受体结合原理蛋白水平的中和抗体检测更加具备生理学相关性，也更加贴合法规监管指导原则的要求。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的提供一种4
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1BB报告基因293T稳转细胞株构建和应用，解决了4
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1BB激动剂药物研发过程中生物活性测定方法和中和抗体测定方法，不能完全表征4
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1BB激活机理和效果或者检测步骤繁琐时间成本高，试剂耗材成本较高，方法稳定性差等难题，本申请的专利技术人构建了4
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1BB报告基因稳转细胞株，并利用该细胞株开发出不限于4
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1BB激动剂类药物的生物活性测定方法和中和抗体测定方法。
[0007]根据本专利技术所提供的一种4
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1BB报告基因293T稳转细胞株构建，使用含4
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1BB基因的质粒转染含NFkB报告基因稳转细胞株单克隆细胞，通过加入真核抗生素筛选和单克隆挑选，经过功能学评价得到合适的4
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1BB报告基因稳转细胞株。
[0008]在一些实施方式中，具体的构建步骤如下：将20ug 4
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1BB基因质粒加入388.3μL Opti
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MEM；混合均匀，然后加入20μL X
‑
tremeGENE转染试剂混匀室温放置半小时。将质粒混合液加入含有5ml DMEM约50％汇合度的NFKB报告基因单克隆细胞株功能单克隆KB
‑
20的10cm平皿中混合均匀，第三天进行细胞换液并且加入1μg/ml puromycin和200μg/ml Hygromycin B的DMEM培养基中进行加压培养。细胞大部分死亡，维持1μg/ml puromycin和200μg/ml Hygromycin B生长传代2次后，将细胞铺以1个/孔，200ul/孔进行96孔板单克隆铺板，96孔板单克隆铺板14天后显微镜下观察每个孔的细胞状况，并挑选出单克隆进入24孔板，24孔板细胞经过1周培养后转入6孔板，然后经T75,T175放大培养得到较优的单克隆NC86。
[0009]在一些实施方式中，所述4
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1BB基因质粒为sinobilogical，Cat.HG10041 4
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1BB基因SEQ ID NO.:2；所述Opti
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MEM的型号为Thermo Fisher，Cat.31985
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070；所述X
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tremeGENE转染试剂的型号为Roche，Cat.6366244001。
[0010]在一些实施方式中，使用含NFkB报告基因的慢病毒转染293T细胞，通过加入真核抗生素筛选本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种4
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1BB报告基因293T稳转细胞株构建，其特征在于，使用含4
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1BB基因的质粒转染含NFkB报告基因稳转细胞株单克隆细胞，通过加入真核抗生素筛选和单克隆挑选，经过功能学评价得到合适的4
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1BB报告基因稳转细胞株。2.根据权利要求1所述的一种4
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1BB报告基因293T稳转细胞株构建，其特征在于，具体的构建步骤如下：将20ug 4
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1BB基因质粒加入388.3μL Opti
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MEM；混合均匀，然后加入20μL X
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tremeGENE转染试剂混匀室温放置半小时。将质粒混合液加入含有5ml DMEM约50％汇合度的NFKB报告基因单克隆细胞株功能单克隆KB
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20的10cm平皿中混合均匀，第三天进行细胞换液并且加入1μg/ml puromycin和200μg/ml Hygromycin B的DMEM培养基中进行加压培养。细胞大部分死亡，维持1μg/ml puromycin和200μg/ml Hygromycin B生长传代2次后，将细胞铺以1个/孔，200ul/孔进行96孔板单克隆铺板，96孔板单克隆铺板14天后显微镜下观察每个孔的细胞状况，并挑选出单克隆进入24孔板，24孔板细胞经过1周培养后转入6孔板，然后经T75,T175放大培养得到较优的单克隆NC86。3.根据权利要求2所述的一种4
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1BB报告基因293T稳转细胞株构建，其特征在于，所述4
‑
1BB基因质粒为sinobilogical，Cat.HG10041 4
‑
1BB基因SEQ ID NO.:2；所述Opti
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MEM的型号为Thermo Fisher，Cat.31985
‑
070；所述X
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tremeGENE转染...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄启宽，朱国振，余跃云，杨雨生，肖敏，
申请(专利权)人：上海精翰生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：