猪视网膜上皮细胞系及其建立方法和应用技术

本发明专利技术公开了猪视网膜上皮细胞系(WWX04

【技术实现步骤摘要】
猪视网膜上皮细胞系及其建立方法和应用


[0001]本专利技术涉及动物细胞工程领域，具体涉及猪视网膜上皮细胞系，还涉及猪视网膜上皮细胞系(WWX04
‑
PR)的建立方法和应用。

技术介绍

[0002]猪圆环病毒(porcine circovirus，PCV)是迄今发现的一种最小的动物病毒。它是断奶仔猪多系统衰竭综合征的主要病原，猪皮炎与肾病综合征、增生性坏死性肺炎、猪呼吸道疾病综合征、繁殖障碍、先天性颤抖、肠炎等疾病亦与PCV2感染有重要关联，给养猪业造成严重的经济损失。现已被世界各国的兽医与养猪业者公认为是继猪繁殖与呼吸综合征(PRRS) 之后新发现的引起猪免疫障碍的最重要传染病。然而PCV2在多数细胞上没有细胞病变，对于PCV2的分离鉴定、致病机理研究以及疫苗研制均有较大的影响，也进一步阻碍了PCV2 的防治和疫病蔓延。前期研究发现PCV2可在猪视网膜细胞中高效增殖且能产生明显的细胞病变，是良好的病毒增殖载体和疫苗研制的素材，而原代细胞不但生产成本高，且操作繁琐，不利于生产应用。因此迫切需要建立猪视网膜上皮细胞系。
[0003]猪是解决各种免疫学问题的宝贵大型动物模型，猪视网膜上皮细胞系的建立，有利于各种免疫学和致病机理的研究，也可以作为药物残留检测工具，也可以开展基因表达规律和生物形状特征的研究。同时，猪和人类视网膜具有相似的结构和特征，猪神经视网膜的离体培养为研究人类视网膜损伤和退行性疾病的机制提供了一个有吸引力的模型。可用于建立和表征成年猪视网膜培养系统作为实时视网膜存活的快速筛查工具的方法。猪视网膜是研究中枢神经系统发育和功能的经典模型。
[0004]因此，现在急需对其方法进行改进，使猪视网膜细胞能够稳定传代下去，达到高细胞活率、高纯度的标准且能得到很好的保藏并延续下去。

技术实现思路

[0005]针对上述现有技术中存在的问题，本专利技术的目的之一在于提供一种易于培养、操作方法简便的猪视网膜上皮细胞系；本专利技术的目的之二在于提供猪视网膜上皮细胞系的应用；本专利技术的目的之三在于提供猪视网膜上皮细胞系的建立方法。
[0006]为达到上述目的，本专利技术提供如下技术方案：
[0007]1、猪视网膜上皮细胞系，所述猪视网膜上皮细胞系保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：C2020112，保藏日为2020年6月18日。
[0008]2、上述猪视网膜上皮细胞系可用于猪圆环病毒、猪伪狂犬病毒、猪流行性腹泻病毒等病毒的分离以及鉴定，并为相关猪圆环病、猪伪狂犬病、流行性腹泻病等相关疫苗抗原制备提供体外培养载体，还可用于病毒如猪圆环病毒、猪伪狂犬病毒、流行性腹泻病毒在猪视网膜上皮细胞增殖特性、复制感染及致病机理等方面的研究；还可以作为解决各种免疫学问题的动物模型，也可以作为药物残留检测工具，甚至可以作为人中枢神经系统发育和功能的经典模型。
[0009]3、所述猪视网膜上皮细胞系的建立方法，具体包括如下步骤：
[0010](1)原代培养：采集初生仔猪的眼球组织，无菌分离出猪视网膜组织，采用组织块法分离，置于37℃，5％CO2条件下培养约7天，获得高活力的原代猪视网膜细胞；
[0011](2)真核表达质粒pCI
‑
neo
‑
E1的构建
[0012]1)pCI
‑
neo质粒的提取
[0013]①
取转化pCI
‑
neo的菌液10μL，加入到含有氨苄西林钠(100μg/mL)的 50mL LB中，放入的37℃摇床8h。
[0014]②
吸取5mL菌液，加入10mL离心管，12000r/min离心1min，弃上清。加入已经添加了RNase A的P1溶液250μL，重悬菌液。加入250μL P2溶液，缓慢地晃动离心管，使液体混合均匀。
[0015]③
添加350μL P3溶液，立即晃动离心管，使液体混匀，此时液体中出现白色絮状沉淀，12000r/min离心10min。
[0016]④
收集上清液转移到CP3吸附柱中(吸附柱提前用平衡液BL平衡)，12000r/min 离心1min，弃去收集管的废液之后再将吸附柱重新放回到收集管。
[0017]⑤
吸取漂洗液PW(提前加好无水乙醇)600μL加入到吸附柱CP3中，12000r/min 离心1min。弃去收集管的废液之后再将吸附柱重新放回到收集管，此步骤再重复一次。 12000r/min离心2min，弃去CP3吸附柱中的残留的液体，以防漂洗液PW中的无水乙醇影响后续实验。
[0018]⑥
将吸附柱CP3转移至干净的1.5mL高压除菌的离心管中，向吸附柱中加入 50～100μL洗脱液EB，常温静置5～6min，12000r/min离心2min，质粒回收到离心管中。
[0019]⑦
使用核酸分光光度仪测量至所提质粒浓度和纯度。
[0020]2)猪腺病毒E1基因的合成：参考NCBI上猪E1基因序列(序列号：NM_001244300)，两端分别加NheⅠ和EcoRⅠ酶切位点后送上海生工生物有限公司合成。
[0021]3)将pCI
‑
neo和E1分别用NheⅠ和EcoRⅠ进行双酶切反应，具体体系如下：
[0022][0023]用漩涡振荡器充分混合均匀反应体系，放置37℃恒温箱中酶切2h。加10μL 6
×ꢀ
loading buffer到酶切产物中，点样至1％的琼脂糖凝胶进行凝胶电泳。将目的条带切下按OMEGA胶回收试剂盒说明书进行回收并测定回收产物浓度分别为pCI
‑
neo为32ng/μ L，E1为102ng/μL。
[0024]4)将回收的pCI
‑
neo和E1按NEB连接酶进行连接反应，具体体系如下：
[0025][0026]用漩涡振荡器充分混合后16℃孵育过夜，转化DH5α大肠杆菌感受态中。
[0027]5)按步骤1)中的方法提取质粒pCI
‑
neo
‑
E1并进行双酶切鉴定，鉴定正确的质粒送上海生工测序。测序结果与NCBI上的序列同源性100％，未发现突变，将质粒置于
‑
20℃保存备用。
[0028](3)G418最小浓度筛选：将G418在100～800μg/mL范围，按每100μg为一个梯度用培养液配置成不同的筛选浓度；取分离的原代猪视网膜细胞接种到96孔培养板，过夜培养后更换不同浓度的G418的培养基，每个浓度做3个重复，37℃，5％CO2培养箱内培养7 天，根据细胞死亡情况确定G418筛选的最小浓度为200μg/mL。
[0029](4)转染：将含有猪腺病毒E1基因的真核表达质粒pCI
‑
neo
‑
E1导入步骤(1)的原代猪视网膜细胞进行转染；
[0030](5)筛选和扩大培养：细胞转染真核表达质粒pCI<本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.猪视网膜上皮细胞系，其特征在于：所述猪视网膜上皮细胞系保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：C2020112，保藏日为2020年6月18日。2.权利要求1所述的猪视网膜上皮细胞系的应用。3.权利要求2所述的应用是指在生产猪圆环疫苗、猪流性腹泻疫苗、猪伪狂犬疫苗中的应用。4.权利要求2所述的猪视网膜上皮细胞系在研究猪圆环病毒、猪流性腹泻病毒、猪伪狂犬病毒在猪视网膜上皮细胞系细胞增殖中的应用。5.权利要求2所述的猪视网膜上皮细胞系在分离或鉴定猪圆环病毒、猪流性腹泻病毒、猪伪狂犬病毒的应用。6.权利要求3所述的应用，其特征在于：所述疫苗为猪圆环病毒疫苗抗原、猪伪狂犬病毒疫苗抗原或猪流行腹泻病毒疫苗抗原。7.权利要求1所述猪视网膜上皮细胞系的建立方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)原代培养：获取猪...

【专利技术属性】
技术研发人员：王文秀，刘博，谷英华，魏凤，谢金文，沈志强，
申请(专利权)人：山东省滨州畜牧兽医研究院，
类型：发明
国别省市：