一种TED缺失的细胞系及其应用制造技术

本发明专利技术属于生物医药领域，具体涉及一种TED缺失的细胞系及其应用。具体地，所述TED缺失的细胞系具有以下特性：耐缺氧环境和/或在缺氧环境中表现神经精神相关疾病抑制效果。缺氧环境中表现神经精神相关疾病抑制效果。缺氧环境中表现神经精神相关疾病抑制效果。

【技术实现步骤摘要】
一种TED缺失的细胞系及其应用


[0001]本专利技术属于生物医药领域，具体涉及一种TED缺失的细胞系及其应用。

技术介绍

[0002]平原人群进入高原、高空和深海等低氧环境时，会引起头痛、头晕、乏力、睡眠不良、急性脑水肿、肺水肿等可能危及生命的缺氧反应，而长期生活在高原的居民和高空、深海中的动物通常耐受缺氧而不会发生缺氧损伤反应。
[0003]研究耐缺氧的分子机制对于特殊职业人群的选拔、预防和治疗缺氧损伤反应极为重要。军人、运动员等特殊职业人群的选拔不仅要关注缺氧耐受表型，同时还要关注其在缺氧环境下的体能表型，这种筛选机制中环境因素与体能因素往往互相影响，导致分子标志物筛选不准确。为探究缺氧耐受的分子机制和提高缺氧环境下核心分子标志物转化为体能表型的筛选准确性，需要发展一种稳定的本身对缺氧耐受的细胞株。
[0004]为获得缺氧耐受细胞株，可以从耐缺氧生物体内分离细胞，但是从耐缺氧生物体内分离细胞不仅涉及伦理问题，而且耗时长、操作繁琐，易污染、培养代数较短，不利于长期的分子机制研究。
[0005]293T细胞来源于人胚胎肾细胞，容易培养且转染效率高，是研究疾病分子机制较常用的细胞，不涉及伦理问题。但是293T细胞不耐受缺氧，在缺氧条件下容易死亡，不利于长期缺氧条件下耐缺氧机制的研究。目前也尚无稳定构建耐缺氧293T细胞株。
[0006]藏族富集性基因缺失(Tibetan
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enriched deletion，TED)序列是一段定位于人类2号染色体的非编码序列。
>[0007]CRISPR/Cas基因编辑技术是新兴的基因工程技术，其是由向导RNA介导的DNA切割技术，针对Cas的不同已经开发出的编辑系统。基因组编辑可以精准的、定向的修饰基因组。CRISPR/Cas编辑技术可以实现至少以下4种精准编辑：第一种是基因的定点敲除，Cas蛋白在向导RNA(gRNA)的指导下识别和切割靶点，产生双链DNA断裂；断裂的DNA通常以非同源末端连接(NHEJ)来修复；在修复时容易产生移码突变以破坏这个基因。第二种是对靶标进行同源置换来更换靶标序列或者定点插入。在产生双链DNA断裂时，如果在附近存在同源修复模板，这时可能发生同源置换或定点插入。同源置换的效率较低，并随着要置换的序列的长度增长而变得更低。第三种是单碱基编辑，单碱基编辑是利用CRISPR/Cas系统将脱氨酶靶向基因组中特定的位点从而对特定碱基进行修饰的基因编辑方法。第四种是基因组引导编辑技术。引导编辑是将逆转录酶与Cas9切口酶结合，在单链引导RNA引导下，按转录模板进行点突变、插入或缺失突变的编辑方法。

技术实现思路

[0008]本专利技术利用CRISPR/Cas9技术将细胞基因中的非编码基因TED(藏族富集性缺失序列，tibetan enriched deletion，TED)序列稳定删除，获得具有耐缺氧特性的稳转细胞株。该细胞株可在缺氧条件下存活，具有易培养、转染效率高的优点，可以长期用于耐缺氧分子
机制的研究，在低氧环境模拟研究方面有较好的应用前景；更有助于提高缺氧环境下核心分子标志物转化为体能表型的筛选准确性。
[0009]为实现以上技术目的，本专利技术提供以下技术方案：
[0010]第一方面，本专利技术提供了TED基因在构建耐缺氧环境和/或在缺氧环境中表现神经精神相关疾病抑制效果的细胞系或动物模型中的应用。
[0011]优选地，所述应用具体是指通过敲除TED基因构建细胞系使所述TED基因敲除的细胞系表现出耐缺氧特征。
[0012]优选地，所述敲除是指TED基因全长缺失；更具体地，所述细胞系或动物模型中有至少一条染色体缺失如SEQ ID NO.:1
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3任意所示片段。
[0013]优选地，如本专利技术具体实施例所验证，所述TED缺失的纯合子或杂合子细胞系在缺氧环境下生长状态正常。
[0014]优选地，所述缺氧环境包括氧气含量低于5％、4％、3％、2％、1％。
[0015]更具体地，所述缺氧环境包括氧气含量为1％；更具体地，如具体实施例所应用的，培养环境气体组成为1％氧气，5％二氧化碳，94％氮气。
[0016]本专利技术所述TED即“藏族富集性基因缺失(Tibetan
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enriched deletion，TED)”所述TED序列是人类2号染色体上位于46,694,276
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46,697,683的基因序列，所述TED是非编码序列。
[0017]术语“野生型”指的是可以在自然界中被发现存在的核酸分子，所述核酸分子包括DNA或RNA，其核苷酸序列可以通过基因工程技术来获得，如基因组测序、聚合酶链式反应(PCR)等。优选地，如本专利技术所述TED野生型的序列如SEQ ID NO.:4所示。
[0018]另一方面，本专利技术提供了一种TED缺失的细胞系，所述细胞系中至少一条染色体上缺失如SEQ ID NO.:1
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3任意所示片段。
[0019]优选地，所述细胞系为杂合子或纯合子。
[0020]如本专利技术所使用，术语“杂合子”是指同源染色体同一位点上的两个等位基因是不相同的基因型，也即本专利技术所述细胞系中TED的基因型有两种。
[0021]更具体地，所述TED缺失的细胞系中：
[0022]1)一条染色体上缺失如SEQ ID NO.:1所示核酸序列，另一条染色体上缺失如SEQ ID NO.:2所述核酸序列；
[0023]2)一条染色体上缺失如SEQ ID NO.:3所示核酸序列，另一条染色体为野生型，所述野生型上包括TED基因野生型。
[0024]优选地，所述TED缺失的细胞系具有以下特性：耐缺氧环境和/或在缺氧环境中表现神经精神相关疾病抑制效果。
[0025]另一方面，本专利技术提供了制备耐缺氧环境和/或在缺氧环境中表现神经精神相关疾病抑制效果的细胞或动物模型的方法，所述方法包括使用Cas9蛋白和gRNA对细胞或动物的TED进行特异性基因编辑，所述gRNA的序列如SEQ ID NO.:5和/或SEQ ID NO.:6所示。
[0026]优选地，所述缺氧环境包括氧气含量低于5％、4％、3％、2％、1％。
[0027]更具体地，所述缺氧环境包括氧气含量为1％；更具体地，如具体实施例所应用的，培养环境气体组成为1％氧气，5％二氧化碳，94％氮气。
[0028]优选地，本专利技术所述基因编辑是CRISPR技术。
[0029]所述CRISPR技术中的基因编辑工具包括向导RNA(gRNA)、Cas蛋白(如Cas9、Cpf1、Cas12b等)，Cas蛋白在向导RNA的引导下可识别并切割靶标DNA。优选地，本专利技术所述靶标DNA即TED。
[0030]如本领域公知，将Cas蛋白或其编码序列、向导RNA或其编码序列转化到细胞中，可以实现对细胞内基因组的编辑，所述编辑的类型包括基因敲除。
[0031]优选地，所述方法包括将以下任意一组成分转本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.TED基因在构建耐缺氧环境和/或在缺氧环境中表现神经精神相关疾病抑制的细胞系或动物模型中的应用。2.如权利要求1所述的应用，所述应用是指通过敲除TED基因构建细胞系或动物模型使所述TED基因敲除的细胞系或动物模型表现出耐缺氧特征；优选地，所述敲除TED基因包括至少一条染色体上缺失如SEQ ID NO.:1
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3任意所示片段；优选地，所述缺氧环境包括氧气含量低于5％、4％、3％、2％或1％。3.一种TED缺失的细胞系，所述细胞系中至少一条染色体上缺失如SEQ ID NO.:1
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3任意所示片段。4.如权利要求3所述的细胞系，所述细胞系中：1)一条染色体上缺失如SEQ ID NO.:1所示核酸序列，另一条染色体上缺失如SEQ ID NO.:2所述核酸序列；2)一条染色体上缺失如SEQ ID NO.:3所示核酸序列，另一条染色体为野生型，所述野生型上包括TED基因野生型；优选地，所述TED基因野生型的序列如SEQ ID NO.:4所示；优选地，所述TED缺失的细胞系具有以下特性：耐缺氧环境和/或在缺氧环境中表现神经精神相关疾病抑制。5.制备耐缺氧环境和/或在缺氧环境中表现神经精神相关疾病抑制的细胞、动物模型的方法，所述方法包括使用Cas9蛋白和gRNA对细胞或动物的TED进行特异性基因编辑；所述gRNA的序列如SEQ ID NO.:5和/或SEQ ID NO.:6所示。6.如权利要求5所述的方法，所述方法包括将以下任意一组成分转入到细胞中：1)Cas9蛋白和gRNA；2)Cas9基因和gRNA的编码序列；优选地，所述Cas...

【专利技术属性】
技术研发人员：王晓礽，贾雪，何昆仑，王琛，赵诚辉，杨晶，吴珏，
申请(专利权)人：中国人民解放军总医院，
类型：发明
国别省市：