一种过表达融合蛋白PTGFRN-GLP-1工程化外泌体的制备方法及其应用技术

本发明专利技术属于生物工程技术领域，具体涉及一种过表达融合蛋白PTGFRN

【技术实现步骤摘要】
一种过表达融合蛋白PTGFRN
‑
GLP
‑
1工程化外泌体的制备方法及其应用


[0001]本专利技术属于生物工程
，具体涉及一种过表达融合蛋白PTGFRN
‑
GLP
‑
1工程化外泌体的制备方法及其应用。

技术介绍

[0002]GLP
‑
1为胰高血糖素样蛋白1，是由肠道内分泌细胞分泌的一种降血糖类激素，是肠促胰素的一种。研究表明其可以降低2型糖尿病受试者的血糖浓度，具有促进胰岛素分泌、抑制胰高血糖素分泌、延迟胃排空等作用。2型糖尿病主要表现为β细胞产生的胰岛素减少，而α细胞产生的胰高血糖素升高，因此GLP
‑
1成为治疗2型糖尿病的重要靶点。虽然GLP
‑
1的用药安全性高，但是天然GLP
‑
1在体内不稳定，半衰期短，注射至血液中仅几分钟就被降解，因此人们对GLP
‑
1的结构进行修饰，产生了很多GLP
‑
1类似物药物，如利拉鲁肽等，可以延长半衰期并且达到降血糖的效果。尽管利拉鲁肽的半衰期较长，但是也需要每天注射，并价格昂贵，存在一定的副作用。因此找到长效的GLP
‑
1药物，并降低其副作用，仍然是目前需要解决的问题。
[0003]外泌体（exsomo）是细胞分泌的一种胞外小泡，是直径为30
‑
150nm的膜结构，由天然的蛋白质和脂质组成，在体内可以由多种类型的细胞分泌，并可以通过体液等方式的运输，到达靶细胞区域，从而影响靶细胞的生存、信号传递、增殖和凋亡等多种生理活动。由于外泌体本身的很多特点，目前已经尝试被运用到疾病的诊断和治疗中。
[0004]中国专利申请CN114644717A公开了一种重组人胰高糖素样肽
‑
1及其构建方法和应用，将GLP
‑
1与ARP通过连接蛋白（Linker）连接组成重组蛋白，置于大肠杆菌原核系统中表达，该种方法获得的重组GLP
‑
1虽然提高了GLP
‑
1的稳定性，延长了半衰期，但是这种方法破坏了GLP
‑
1的天然蛋白结构，容易降低天然GLP
‑
1本身的治疗效果。
[0005]中国专利CN101044162B公开了一种GLP
‑
1 类似物融合蛋白质制剂，所述稳定溶液制剂包含GLP
‑1‑
Fc融合体，pH在约pH6至约pH8.5之间，是特定IgG4
‑
Fc衍生物融合的类似物，当与pH在上述范围之外的GLP
‑1‑
Fc融合体相比时，这些制剂具有相当高的化学稳定性，可用于疗糖尿病、肥胖、肠易激综合征等，但是这种制剂需在特定pH范围内才能达到稳定性高的效果，本身增加了制剂的制备难度，而且，这种制剂同样破坏了GLP
‑
1的天然结构，容易影响治疗效果。
[0006]综上可知，现有技术中仍无法解决天然GLP
‑
1体内稳定性差、易被降解等问题。

技术实现思路

[0007]针对现有技术普遍存在的问题，本专利技术提供了一种过表达融合蛋白PTGFRN
‑
GLP
‑
1工程化外泌体的制备方法及其应用。本专利技术提供的融合蛋白在发挥天然GLP
‑
1作用的同时，还解决了天然GLP
‑
1体内不稳定等问题。
[0008]为了解决上述问题，本专利技术采用的技术方案为：
一种过表达融合蛋白PTGFRN
‑
GLP
‑
1工程化外泌体的制备方法，包括如下过程：S1、将表达目的蛋白GLP
‑
1和PTGFRN的目的基因连接在pcDNA3.1质粒上，构建pcDNA3.1
‑
PTGFRN
‑
GLP
‑
1融合表达载体；S2、将步骤S1所得pcDNA3.1
‑
PTGFRN
‑
GLP
‑
1融合表达载体转入DH5α大肠杆菌感受态中，提取质粒，然后将提取的质粒转染入干细胞中转染48h后，收集培养细胞的上清液，获得条件培养基；S3、去除步骤S2所得条件培养基中的细胞碎片和凋亡小体，进一步浓缩、纯化、鉴定即得。
[0009]优选地，步骤S1所述pcDNA3.1
‑
PTGFRN
‑
GLP
‑
1融合表达载体的具体构建过程为：（1）将GLP
‑
1与PTGFRN片段通过基因合成，并导入T
‑
Vevtor载体中，获得T
‑
Vector
‑
PTGFRN
‑
GLP
‑
1载体；（2）用BamHI和EcoRI将步骤（1）所得T
‑
Vector
‑
PTGFRN
‑
GLP
‑
1载体和pcDNA3.1质粒分别进行双酶切，酶切产物17℃进行酶连，获得酶连产物；（3）将步骤（2）所得酶连产物进行凝胶回收，即得。
[0010]优选地，步骤（1）中所述GLP
‑
1基因片段的基因库序号为KC404695.1；所述PTGFRN基因片段的基因库序号为NM_020440.4。
[0011]优选地，步骤S2中所述干细胞在转染前用干细胞完全培养基培养至细胞汇合度达到70
‑
80%时转染。
[0012]优选地，步骤S2所述干细胞为人脐带间充质干细胞、人骨髓间充质干细胞、脂肪间充质干细胞、胎盘间充质干细胞、羊水间充质干细胞、HEK293T细胞中的一种。
[0013]优选地，步骤S2所述转染方法为电穿孔法、慢病毒感染、脂质体转染中的一种。
[0014]优选地，步骤S3所述浓缩、纯化过程采用切向流技术，具体操作过程如下：（1）连接中空纤维装置，设置流速为70mL/min，用0.22μm过滤的纯净水冲洗柱子至滤出端pH为中性，再用PBS冲洗5min；（2）上样品：将需要浓缩纯化的外泌体溶液通过中空纤维，设置流速为70mL/min，跨膜压为1.5 Psi；（3）当样品浓缩至50mL时，改为循环模式，用PBS替换培养基，当培养基完全替换为PBS溶液时，停止循环；（4）中空纤维柱子用0.22μm过滤的纯净水冲洗20min，再用0.5M NaOH溶液冲洗5min，用200nm孔径的过滤器进行过滤，去掉直径大于200nm的囊泡，过滤后的溶液为外泌体溶液。
[0015]（5）最后用0.22μm滤膜对步骤（4）获得的外泌体溶液进行过滤，得到无菌外泌体溶液。
[0016]本专利技术还提供了一种所述方法制得的过表达融合蛋白PTGFRN
‑
GLP
‑
1工程化外泌体。
[0017]本专利技术还提供了一本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种过表达融合蛋白PTGFRN
‑
GLP
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1工程化外泌体的制备方法，其特征在于，包括如下过程：S1、将表达目的蛋白GLP
‑
1和PTGFRN的目的基因连接在pcDNA3.1质粒上，构建pcDNA3.1
‑
PTGFRN
‑
GLP
‑
1融合表达载体；S2、将步骤S1所得pcDNA3.1
‑
PTGFRN
‑
GLP
‑
1融合表达载体转入DH5α大肠杆菌感受态中，提取质粒，然后将提取的质粒转染入干细胞中转染48h后，收集培养细胞的上清液，获得条件培养基；S3、去除步骤S2所得条件培养基中的细胞碎片和凋亡小体，进一步浓缩、纯化、鉴定即得。2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤S1所述pcDNA3.1
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PTGFRN
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GLP
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1融合表达载体的具体构建过程为：（1）将GLP
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1与PTGFRN片段通过基因合成，并导入T
‑
Vevtor载体中，获得T
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Vector
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PTGFRN
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GLP
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1载体；（2）用BamHI和EcoRI将步骤（1）所得T
‑
Vector
‑
PTGFRN
‑
GLP
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1载体和pcDNA3.1质粒分别进行双酶切，酶切产物17℃进行酶连，获得酶连产物；（3）将步骤（2）所得酶连产物进行凝胶回收，即得。3.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）中所述GLP
‑
1基因片段的基因...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘洪玉，姜舒，张芸，纪惜銮，
申请(专利权)人：深圳市茵冠生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：