一种利用尿液微囊泡蛋白作为肾癌诊断标志物的应用制造技术

本发明专利技术公开了一种利用尿液微囊泡蛋白作为肾癌诊断标志物的应用。与肾透明细胞癌相关的尿液细胞外囊泡来源的蛋白标志物，其特征在于选自下列蛋白中的任意一种或多种：CSPG4，AQP1，PLIN2，CA9，HAVCR1。检测所述的蛋白标志物的试剂在制备肾透明细胞癌辅助诊断试剂中的应用。发明专利技术人通过流式细胞仪技术在200例患者中分析发现，尿液细胞外囊泡来源的5种蛋白能够有效将肾透明细胞癌患者和对照组(包括健康人、良性肾肿瘤患者、良性肾囊肿患者和慢性肾病患者)区分开。肾病患者)区分开。肾病患者)区分开。

【技术实现步骤摘要】
一种利用尿液微囊泡蛋白作为肾癌诊断标志物的应用


[0001]本专利技术属于医学诊断领域，涉及一种利用尿液微囊泡蛋白作为肾癌诊断标志物的应用。

技术介绍

[0002]肾癌是泌尿系统常见的恶性肿瘤之一。全球发病率不断上升，成人约4％的恶性疾病为肾癌，在每年的泌尿系肿瘤的死亡率中居首位。许多肾癌发展到晚期仍没有明显的症状，出现肾癌经典3大症状(血尿、腹部肿块、疼痛)的患者仅20％左右。50％的患者在体检时通过影像学检查偶然发现，在诊断时约16％的肾癌已经发生转移，多数患者只能采用姑息性治疗，其预后差，5年生存率低于10％。因此，积极寻找肾癌敏感的标志物对早期及微小肾癌的诊断具有重要作用。
[0003]细胞外囊泡(extracellular vesicles，EVs)是由细胞释放的富含蛋白质、胆固醇、磷脂等多种生物活性物质的具膜囊泡。EVs包含的生物活性物质不仅可以反映其来源的细胞，而且还会随着来源细胞所处的生理或病理学状态而发生相应的变化。EVs可被细胞释放到各种体液中，如血液、尿液、腹水、羊水、支气管肺泡液等，其外部膜结构具有保护作用，能避免内容物被蛋白酶、核酸酶水解，从而使EVs成为疾病诊断的理想标志物。尿液是一种流动性体液，因其无创性，易获取大标本量，是理想的肾脏病生物学标志物的来源。研究表明，尿液中的 EVs主要来源于肾单位各个阶段的固有细胞、尿液通路上皮细胞等，尿液EVs中的蛋白质、核酸等生物活性物质能够成为肾脏疾病等多种泌尿系统疾病的生物标志物。在本专利技术中，我们研发了一种从尿液中富集细胞外囊泡，通过高通量蛋白质谱技术和流式细胞仪技术鉴定了一组与肾透明细胞癌相关的尿液细胞外囊泡来源的蛋白。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的就是提供对肾透明细胞癌进行诊断的尿液细胞外囊泡来源的蛋白标志物。
[0005]本专利技术的另一目的是提供所述标志物的应用。
[0006]本专利技术的又一目的是提供检测所述标志物的试剂及其应用。
[0007]本专利技术的目的可通过以下技术方案实现：
[0008]与肾透明细胞癌相关的尿液细胞外囊泡来源的蛋白，包括下列蛋白中的任意一种或多种：Chondroitin sulfate proteoglycan 4(CSPG4)，Aquaporin
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1 (AQP1)，Perilipin
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2(PLIN2)，Carbonic anhydrase
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9(CA9)，Kidney injurymolecule
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1(HAVCR1)。
[0009]本专利技术所述的尿液细胞外囊泡来源的蛋白标志物，优选包括Chondroitinsulfate proteoglycan 4(CSPG4)，Aquaporin
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1(AQP1)，Perilipin
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2(PLIN2)， Carbonic anhydrase
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9(CA9)，Kidney injury molecule
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1(HAVCR1)的组合。
[0010]本专利技术中所述的细胞外囊泡提取自尿液。
[0011]检测本专利技术所述的尿液细胞外囊泡来源的蛋白标志物的检测试剂。
[0012]所述的检测试剂优选为检测本专利技术所述的与肾透明细胞癌相关的尿液细胞外囊泡来源的蛋白标志物的引物或芯片。
[0013]本专利技术所述的与肾透明细胞癌相关的尿液细胞外囊泡来源的蛋白标志物作为检测靶点在制备肾透明细胞癌诊断试剂中的应用。
[0014]本专利技术所述的检测试剂在制备肾透明细胞癌诊断试剂中的应用。
[0015]一种肾透明细胞癌诊断试剂，包含本专利技术所述的尿液细胞外囊泡来源的蛋白标志物的检测试剂。
[0016]有益效果：
[0017]专利技术人通过高通量蛋白质谱技术发现尿液细胞外囊泡中有5种蛋白仅在肾透明细胞癌患者中表达，而在对照组(包括健康人、良性肾肿瘤和良性肾囊肿)中几乎不表达。专利技术人进一步通过流式细胞仪技术在200例患者中分析发现，尿液细胞外囊泡来源的5种蛋白能够有效将肾透明细胞癌患者和对照组(包括健康人、良性肾肿瘤患者、良性肾囊肿患者和慢性肾病患者)区分开。总体来说，尿液细胞外囊泡中的蛋白可以作为检测标志物应用于肾透明细胞癌的诊断、分期和预后。
附图说明
[0018]图1显示了凝集素偶联的磁珠捕获尿液细胞外囊泡并通过流式细胞仪测定尿液细胞外囊泡蛋白的示意图。
[0019]图2尿液细胞外囊泡蛋白表达谱。A尿液细胞外囊泡差异蛋白热图。蓝色代表在肾透明细胞癌尿液细胞外囊泡下降的蛋白；红色的点代表在在肾透明细胞癌尿液细胞外囊泡上升的蛋白。B火山图。蓝色代表在肾透明细胞癌尿液细胞外囊泡下降的蛋白；红色的点代表在在肾透明细胞癌尿液细胞外囊泡上升的蛋白；黑色的点代表在肾透明细胞癌尿液细胞外囊泡中不变的蛋白。
[0020]图3显示了利用流式细胞仪测定的Chondroitin sulfate proteoglycan 4(CSPG4) 蛋白A，Aquaporin
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1(AQP1)蛋白B，Perilipin
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2(PLIN2)蛋白C，Carbonicanhydrase
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9(CA9)蛋白D，Kidney injury molecule
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1(HAVCR1)蛋白E 蛋白在肾透明细胞癌患者和对照组(包括健康人、良性肾肿瘤患者、良性肾囊肿患者和慢性肾病患者)尿液微囊泡中的表达含量。
[0021]图4显示了尿液微囊泡中的Chondroitin sulfate proteoglycan 4(CSPG4)蛋白A，Aquaporin
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1(AQP1)蛋白B，Perilipin
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2(PLIN2)蛋白C，Carbonicanhydrase
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9(CA9)蛋白D，Kidney injury molecule
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1(HAVCR1)蛋白E 和五个指标联合使用F鉴别肾透明细胞癌与对照样本的ROC曲线。
[0022]表格1.仅在肾透明细胞癌患者尿液微囊泡中能够检测到，而在对照组(包括健康人、良性肾肿瘤和良性肾囊肿)尿液微囊泡中几乎检测不到的蛋白。
[0023]具体实施方式
[0024]实施例1凝集素偶联的磁珠构建
[0025]1.购买粒径为2μm的NHS磁珠(Solarbio,货号M2450)，取500μL磁珠悬浮液于 1.5mL EP管中，将EP管置于磁性分离架内，富集磁珠，去除上清液。加1mL4℃预冷的Washing Buffer A于1.5mL EP管中，涡旋15s，使磁珠混合均匀。将EP管置于磁性分离架内，富集磁珠，去除上清液。
[0026]2.称取麦胚凝集素冻干粉，用Coupling Buffer缓冲液(Solarbio,货号M2450) 重悬为3.0mg/mL的蛋白溶液。向第一步的EP管中加入5本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.与肾透明细胞癌相关的尿液细胞外囊泡来源的蛋白标志物，其特征在于选自下列蛋白中的任意一种或多种：CSPG4，AQP1，PLIN2，CA9，HAVCR1。2.根据权利要求1所述的蛋白标志物，其特征在于所述的蛋白标志物由CSPG4，AQP1，PLIN2，CA9和HAVCR1组成。3.检测权利要求1或2所述的蛋白标志物的试剂在制备肾透明细胞癌辅助诊断试剂中的应用。4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于所述的检测权利要求1或2所述的蛋白标志物的试剂为检测权利要求1或2所述的蛋白标志物编码基因的引物或芯片。5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于所述的检测权利要求...

【专利技术属性】
技术研发人员：权利要求书一页说明书四页附图二页，
申请(专利权)人：中国药科大学，
类型：发明
国别省市：