一种用于检测BCR/-ABL1融合基因的试剂盒及其使用方法技术

本发明专利技术提供一种用于检测BCR/

【技术实现步骤摘要】
一种用于检测BCR/
‑
ABL1融合基因的试剂盒及其使用方法


[0001]本专利技术涉及融合基因检测
，特别涉及一种用于检测BCR/
‑
ABL1融合基因的试剂盒及其使用方法。

技术介绍

[0002]BCR/ABL1融合基因是由t(9:22)(q34:11)易位形成，即由9号染色体q34中的ABL1基因易位至22号染色体q11中的BCR基因上而引发的基因重排事件，经此易位后的22号染色体也称为费城染色体(ph)。ABL1为一原癌基因，包括1b、1a和2
‑
11共12个外显子(exon)，其产物是一种非受体型酪氨酸蛋白激酶，该基因可能发生断裂的断裂位点位于跨度约170kb的第1或第2内含子区域内；BCR基因共有23个外显子(exon)，正常产物为160kD的胞质磷酸蛋白，其最常发生的断裂位置在外显子e12
‑
e16的区域内，称为主要断裂区(M
‑
bcr)，该区域长约7kb，另外还有发生在长约80kb的e1
‑
e2的小断裂区(m
‑
bcr)和发生在长约2.8kb的e19
‑
e21的第三断裂区(μ
‑
bcr)。根据BCR和ABL1断裂位点的不同，两者融合后产生BCR/ABL1融合基因共可翻译出三种不同长度的融合蛋白：蛋白230KD(m
‑
bcr)、210KD(M
‑
bcr)、190KD(μ
‑
bcr)。210KD发生于大部分的慢性粒细胞性白血病(CML)和1/3的Ph阳性的急性淋巴细胞性白血病(Ph+ALL)，190KD常发生于2/3的Ph+ALL和极少数的CML，而230KD一般与慢性中性粒细胞白血病有着紧密联系。上述融合蛋白的表达可激活酪氨酸蛋白激酶，扰乱正常的信号传导途径，抑制凋亡的发生，最终导致相应白血病的发生。
[0003]因此，作为多种白血病驱动因素的BCR/ABL1融合基因已作为相关疾病的分子生物学特异性标志物用于临床诊断。BCR/ABL1融合基因存在于90％以上的慢性粒细胞性白血病(CML)患者，并作为CML的确定诊断依据。具有BCR/ABL融合基因的患者预后差，临床上可以根据患者是否存在BCR/ABL融合基因来选择性地使用分子靶向治疗药物，例如FDA批准且NCCN指南、ELN指南推荐的CML慢性期患者一线治疗酪氨酸激酶抑制剂(TKI)，包括依马替尼、尼洛替尼、达沙替尼、博苏替尼。在CML治疗期间BCR/ABL1融合基因存在于CML的整个病程中，治疗缓解后仍持续存在，只有消除其阳性克隆，才能达到最终治疗。此外，在30％左右成人ALL、2％～10％儿童ALL以及少数急性粒细胞性白血病(AML)和多发性骨髓瘤(MM)的患者中也可表达BCR/ABL1融合基因。在上述白血病中，BCR/ABL1融合基因也具有重要作用，例如BCR/ABL融合基因阳性的ALL对化疗反应差、复发率高等。因此，对于BCR/ABL1融合基因的检测对于指导相关白血病的诊断、分型、治疗及预后具有极其重要的临床意义。
[0004]当前用于BCR/ABL1融合基因检测的方法主要包括免疫组化(IHC)、实时荧光定量聚合酶链反应(qPCR)、荧光原位杂交(FISH)和第二代测序技术(NGS)等几种方法。然而，这些方法均有一定的局限性，第一种方法IHC是基于蛋白水平对融合蛋白进行检测，无法直接检测融合基因，对结果的判读主观性较强；后三种方法是基于RNA或DNA水平对融合基因进行检测，其中qPCR只能基于已知的转录本、且很小的序列范围内检测出BCR/ABL1融合基因；而FISH操作复杂、技术要求高、且不能检测出精确的融合位点；NGS虽能精确定位BCR/ABL1融合位点和识别出新的融合基因，但其测序读长短、依赖于PCR扩增、受GC含量影响，无法实
现对特地区域的直接靶向富集测序，因而在融合位点高度可变的BCR/ABL1融合基因检测方面作用仍受限。

技术实现思路

[0005]基于此，本专利技术的目的是提供一种用于检测BCR/
‑
ABL1融合基因的试剂盒及其使用方法，以至少解决上述相关技术中的不足。
[0006]本专利技术提出一种用于检测BCR/
‑
ABL1融合基因的试剂盒，包括：
[0007]源自CRISPR的crRNA探针，所述crRNA探针包括靶位点位于BCR基因小断裂区上游的BCR_23177704crRNA，及靶位点位于BCR基因的主要断裂区上游的BCR
‑
23285486crRNA和BCR
‑
23286143crRNA；
[0008]反式激活crRNA，所述反式激活crRNA通用、且与所述crRNA探针退火为嵌合向导RNA；
[0009]以及，CRISPR相关蛋白9，所述CRISPR相关蛋白9具有核酸内切酶活性，与所述嵌合向导RNA组装成核糖核蛋白复合体，并在所述嵌合向导RNA的引导下对基因组双链DNA中的靶位点进行切割，使双链DNA断裂；
[0010]通过以上试剂构成CRISPR/Cas9靶向富集系统。
[0011]进一步的，所述3条crRNA探针的5
’
端与靶位点序列互补配对的长度为20个核苷酸，且与所述3条crRNA探针靶位点相邻的3
’
端序列为PAM基序，所述3条crRNA探针的5
’
端的序列及相应靶位点的PAM基序如下所示：
[0012]BCR_23177704crRNA：5
’‑
CAAGGGAGAAAGCCACTATC
‑3’
；5
’‑
TGG
‑3’
；
[0013]BCR
‑
23285486crRNA：5
’‑
CACGGGATACTTCTTAGACC
‑3’
；5
’‑
TGG
‑3’
；
[0014]BCR
‑
23286143crRNA：5
’‑
CCATACAAGCTACCCTGATG
‑3’
；5
’‑
GGG
‑3’
。
[0015]进一步的，所述3条crRNA探针在每个基因组双链DNA样本中对其相应靶位点的靶向效率通过实时荧光定量聚合酶链反应实验进行质控。
[0016]进一步的，所述实时荧光定量聚合酶链反应实验质控3条crRNA探针的靶向效率所用的引物对分别为BCR_23177704FP/RP、BCR
‑
23285486FP/RP和BCR
‑
23286143FP/RP，所述引物对序列如下所示：
[0017]BCR_23177704FP：5
’‑
CCAACCCAACCCTCCAGAA
‑3’
；...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于检测BCR/
‑
ABL1融合基因的试剂盒，其特征在于，包括：源自CRISPR的crRNA探针，所述crRNA探针包括靶位点位于BCR基因小断裂区上游的BCR_23177704 crRNA，及靶位点位于BCR基因的主要断裂区上游的BCR
‑
23285486 crRNA和BCR
‑
23286143 crRNA；反式激活crRNA，所述反式激活crRNA通用、且与所述crRNA探针退火为嵌合向导RNA；以及，CRISPR相关蛋白9，所述CRISPR相关蛋白9具有核酸内切酶活性，与所述嵌合向导RNA组装成核糖核蛋白复合体，并在所述嵌合向导RNA的引导下对基因组双链DNA中的靶位点进行切割，使双链DNA断裂；通过以上试剂构成CRISPR/Cas9靶向富集系统。2.根据权利要求1所述的用于检测BCR/
‑
ABL1融合基因的试剂盒，其特征在于，所述3条crRNA探针的5
’
端与靶位点序列互补配对的长度为20个核苷酸，且与所述3条crRNA探针靶位点相邻的3
’
端序列为PAM基序，所述3条crRNA探针的5
’
端的序列及相应靶位点的PAM基序如下所示：BCR_23177704crRNA：5
’‑
CAAGGGAGAAAGCCACTATC
‑3’
；5
’‑
TGG
‑3’
；BCR
‑
23285486crRNA：5
’‑
CACGGGATACTTCTTAGACC
‑3’
；5
’‑
TGG
‑3’
；BCR
‑
23286143crRNA：5
’‑
CCATACAAGCTACCCTGATG
‑3’
；5
’‑
GGG
‑3’
。3.根据权利要求2所述的用于检测BCR/
‑
ABL1融合基因的试剂盒，其特征在于，所述3条crRNA探针在每个基因组双链DNA样本中对其相应靶位点的靶向效率通过实时荧光定量聚合酶链反应实验进行质控。4.根据权利要求3所述的用于检测BCR/
‑
ABL1融合基因的试剂盒，其特征在于，所述实时荧光定量聚合酶链反应实验质控3条crRNA探针的靶向效率所用的引物对分别为BCR_23177704 FP/RP、BCR
‑
23285486 FP/RP和BCR
‑
23286143 FP/RP，所述引物对序列如下所示：BCR_23177704 FP：5
’‑
...

【专利技术属性】
技术研发人员：万绍贵，谢水莲，杨影，
申请(专利权)人：赣南医学院，
类型：发明
国别省市：