一种人肿瘤特异性BRAF突变检测方法技术

本发明专利技术公开了基因检测技术领域的一种人肿瘤特异性BRAF突变检测方法，所述检测方法采用检测人BRAF基因突变的PCR试剂盒，所述PCR试剂盒包括核酸扩增试剂和对照品所述核酸扩增试剂包括BRAFV600E反应液和BRAFV600K反应液；BRAFV600E反应液和BRAFV600K反应液中分别含有用于检测BRAFV600E和V600K突变的特异性引物和探针。该检测人BRAF基因突变的PCR试剂盒采用等位基因特异性扩增定量PCR技术，对BRAF基因V600E和V600K突变进行定性检测，从而辅助结直肠癌、甲状腺癌和黑色素瘤临床诊断并指导相关患者进行治疗和检测，具有高特异性、确性和高灵敏度。和高灵敏度。和高灵敏度。

A human tumor specific BRAF mutation detection method

【技术实现步骤摘要】
一种人肿瘤特异性BRAF突变检测方法


[0001]本专利技术涉及基因突变检测
的一种人肿瘤特异性BRAF突变检测方法。

技术介绍

[0002]BRAF基因是人类最重要的原癌基因之一,位于人染色体7q34,由18个外显子组成,编码蛋白约94kDa。BRAF能够活化丝裂原活化蛋白激酶/细胞外信号调节激酶 (MAPK/ERK)信号通路,该通路将细胞外的各种生长因子、细胞因子及激素的改变信息传递到细胞核,通过配体与酪氨酸激酶受体表面相结合形成二聚体和酪氨酸残基自磷酸化。BRAF突变直接导致丝裂原活化的细胞外信号调节蛋白激酶 (MEK)活化并继续活化ERK,致使MAPK通路激活,进而导致细胞周期和循环失控,促进肿瘤的发生。
[0003]BRAF是黑色素瘤最常见的突变基因,突变发生率为 40％～60％,V600E(1799T>A)突变是主要的BRAF突变类型。另一种此位置的突变类型是V600K(1798G>A),较少发生,但发生V600K突变的黑色素瘤患者较V600E突变的患者更易发生肺和脑转移,并且生存率更低,提示V600E突变影响蛋白表达。BRAF突变和黑色素瘤的发病部位及病理分型有一定关系,浅表扩散型突变率为63.2％,结节性黑色素瘤为50.4％, 恶性雀斑样黑色素瘤和肢端雀斑样黑色素瘤突变率较少, 分别为20％和11％。随着FDA批准BRAF突变抑制剂威罗菲尼应用,对于那些不能切除的或者转移的黑色素瘤进行靶向治疗的尝试,已取得了良好的效果。
[0004]根据组织发生和形态结构甲状腺癌可分为乳头状甲状腺癌(papillary thyroid carcinoma,PTC)、滤泡型癌、髓样癌、未分化癌、转移癌。其中,乳头状甲状腺癌是最常见的甲状腺癌的类型,约占甲状腺癌的50％。BRAF基因发生在甲状腺癌的突变位点几乎都是V600E突变,突变率为 40％～68％。BRAF突变在儿童PTC的发生率明显较低,约31％。研究发现,BRAF基因突变和乳头状癌病理类型明显相关,而在滤泡型癌、髓样癌和良性甲状腺增生中均未见突变。BRAFV600E突变还和肿瘤不良的病理生物行为有关,Xing等发现 V600E突变与肿瘤的复发密切相关并和甲状腺包膜外侵袭、肿瘤多中心型、肿瘤III和IV分期、肿瘤包膜缺如相关。 Finkelstein等提出,BRAF突变和PTC的典型肿瘤细胞核特征、浸润性生长、包膜不完整或缺如、淋巴结转移、复发等相关,推测V600E突变后使得BRAF活性增加,促进细胞增殖从而引发肿瘤,这可能是PTC发生的一个重要分子机制。基于以上研究,BRAF突变已被认为可以作为PTC预后评估的一个独立指标,更多临床应用研究的展开也为PTC患者的治疗及综合方案的制定提供明确依据。
[0005]直肠结肠癌(colorectal cancer,CRC)是常见的恶性肿瘤。研究表明,CRC发生与多种基因突变密切相关,其中包括KRAS、BRAF、MEK、ERK。以上基因均参与细胞增殖、分化、凋亡以及血管形成等过程的调节。有50％左右的CRC患者表现为BRAF和KRAS基因突变,这些突变病例采用外科治疗存在一定困难,所以倾向于选择基因靶向治疗。BRAFV600E突变更易发生在具有不稳定的微小卫星肿瘤病例中。存在错配基因参与的林奇(Lynch)综合征的患者并没有发生 BRAF突变,所以通过临床BRAF突变的检测可筛选出那些属于真正林奇综合征相关直肠结肠癌患者。还有研究发现, BRAF突变和因癌致死的高风险联系在一起,约有
超过半数的BRAF突变阳性标本呈现不良的癌分化,伴淋巴结转移和神经侵犯。在CRC肝转移的患者中,BRAF突变往往提示不良预后,所以,部分学者考虑将BRAF作为肿瘤分子标志物对 CRC预后进行分级评估。
[0006]由于BRAF基因突变在以上疾病诊疗中的重要作用，目前对于BRAF基因突变状态的检测已成为辅助肿瘤诊断和治疗的重要手段之一。临床上基因突变检测的金标准是Sanger 测序法，此方法的优点是实验方法简单，结果直观可靠，成本较低。经过几十年的临床应用，已经得到广大医务人员的认可，但该技术检测灵敏度较不高，且检测周期较长。随着荧光定量PCR技术的发展，越来越多的相关基因检测产品被推上市场，相比Sanger测序法，荧光PCR技术仅需2小时即可得到检测结果，分辨率可低至1％，具有明显的优势。鉴于此，特提出本申请。

技术实现思路

[0007]本专利技术的目的在于提供一种人肿瘤特异性BRAF突变检测方法，以解决上述
技术介绍
中提出的问题。
[0008]本专利技术是通过以下技术方案实现的：
[0009]一种人肿瘤特异性BRAF突变检测方法，其特征在于：所述检测方法采用检测人BRAF基因突变的PCR试剂盒，所述PCR试剂盒包括核酸扩增试剂和对照品，所述核酸扩增试剂包括BRAF V600E反应液和BRAF V600K反应液；BRAF V600E 反应液和BRAF V600K反应液中分别含有用于检测BRAF V600E 和V600K突变的特异性引物和探针；BRAF V600E反应液和 BRAF V600K反应液中均包含一对上游引物和下游引物，以及 TaqMan荧光探针，所述BRAF V600E反应液和BRAF V600K反应液中用于检测BRAF V600E和V600K突变的特异性引物和探针的核苷酸序列如SEQ ID NO：1
‑
6所示。
[0010]对上述技术方案做进一步的说明：所述BRAF V600E反应液和BRAF V600K反应液中还包括用于对样本质量进行质控的内参引物和探针，本试剂盒中选择的内参引物为ACTB 基因。
[0011]对上述技术方案做进一步的说明：所述BRAF V600E反应液和BRAF V600K反应液中用于扩增ACTB基因的引物和探针的核苷酸序列如SEQ ID NO：7
‑
9所示。
[0012]对上述技术方案做进一步的说明：所述BRAF V600E反应液和BRAF V600K反应液中包含的引物含量的浓度为： 100μmol/L的引物各0.06μL，浓度为100μmol/L的探针各0.04μL。
[0013]对上述技术方案做进一步的说明：所述核酸扩增试剂还包括BRAF PCR MIX，BRAF PCRMIX中包括dNTP、KCl、Tris
‑
HCl、 MgCl 2和Taq酶；该MIX为2
×
工作液，配制时加入体积为总体系量的一半。
[0014]对上述技术方案做进一步的说明：所述检测人BRAF基因突变的PCR试剂盒中还包括阳性对照和阴性对照，其中，阴性对照为工艺用水，阳性对照为突变质粒和野生型细胞株 DNA混合物。
[0015]对上述技术方案做进一步的说明：所述突变质粒包含的 BRAF基因片段的核苷酸序列如SEQ ID NO：10和SEQ ID NO： 11所示。
[0016]与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：
[0017](1)该检测人B本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种人肿瘤特异性BRAF突变检测方法，其特征在于：所述检测方法采用检测人BRAF基因突变的PCR试剂盒，所述PCR试剂盒包括核酸扩增试剂和对照品，所述核酸扩增试剂包括BRAF V600E反应液和BRAF V600K反应液；BRAF V600E反应液和BRAF V600K反应液中分别含有用于检测BRAF V600E和V600K突变的特异性引物和探针；BRAF V600E反应液和BRAF V600K反应液中均包含一对上游引物和下游引物，以及TaqMan荧光探针，所述BRAF V600E反应液和BRAF V600K反应液中用于检测BRAF V600E和V600K突变的特异性引物和探针的核苷酸序列如SEQ ID NO：1
‑
6所示。2.根据权利要求1所述的一种人肿瘤特异性BRAF突变检测方法，其特征在于：所述BRAFV600E反应液和BRAF V600K反应液还包括用于对样本质量进行质控的内参引物和探针，本试剂盒中选择的内参引物为ACTB基因。3.根据权利要求1一种人肿瘤特异性BRAF突变检测方法，其特征在于：所述BRAFV600E反应液和BRAF V600K反应液中用于扩增ACTB基因的引物和探针...

【专利技术属性】
技术研发人员：石涵，龚伟，高伙妮，
申请(专利权)人：上海睿璟生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：