一种抗大肠杆菌的噬菌体内溶素及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种抗大肠杆菌的噬菌体内溶素及其应用。该噬菌体内溶素的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明专利技术将噬菌体内溶素的基因(SEQ ID NO.2)克隆进入表达载体，得到重组表达载体，然后将其转入宿主菌株，经诱导表达获得噬菌体内溶素蛋白，该生产方法操作简单、蛋白纯度较高，具有良好的稳定性和生物学活性，对大肠杆菌具有一定杀菌作用，能够有效地控制大肠杆菌病，可应用于生产和实践中保障公共卫生安全。共卫生安全。共卫生安全。

An anti Escherichia coli bacteriolysin and its application

【技术实现步骤摘要】
一种抗大肠杆菌的噬菌体内溶素及其应用


[0001]本专利技术属于生物
，特别涉及一种抗大肠杆菌的噬菌体内溶素及其应用。

技术介绍

[0002]畜禽生长过程中感染细菌已是屡见不鲜的事情。大肠杆菌作为一种消化道常在菌，容易造成动物的高发病率和高死亡率，增加动物的治疗成本，同时严重影响养殖行业的经济效益。饲料、饮水以及传播媒介等都可能成为大肠杆菌的感染来源，并且大肠杆菌在动物的羽毛、粪便、舍内空气等中广泛存在。由于大肠杆菌的血清型具有多样性，并且各个血清型之间的交叉免疫效果不高，采用疫苗无法防止和减少大肠杆菌的感染和携带。因此针对大肠杆菌病，常常使用抗生素来进行治疗并且都能有效地控制病情，然而长期大量地使用抗生素却导致如今大肠杆菌非常容易产生耐药性。抗生素对大肠杆菌无法起作用的情况并不罕见，甚至威胁食品卫生安全。
[0003]为避免滥用抗生素带来的不良影响，科学家们也在不断尝试开发新型的动物专用抗菌药物及其替代品，其中噬菌体疗法备受关注。噬菌体是一类以细菌、真菌等微生物为宿主的病毒，并且广泛分布于自然环境和人体。与抗生素疗法截然不同的是噬菌体疗法可以特异性地裂解宿主细菌，对特定的细菌进行防控，对其他正常菌群不造成影响。噬菌体独特的作用机制在避免细菌耐药性上具有极大优势。此外，与研发新的抗生素相比，从自然界中分离获得噬菌体在时间和经济成本上也占有优势。在临床实践上，我们已经能够通过噬菌体来清除病患或病畜体内的病原菌和改善相应的病症。
[0004]内溶素是由噬菌体编码的一种高度进化的肽聚糖水解酶，本质为一种蛋白分子，弥补了噬菌体本质为病毒的不足，较噬菌体直接治疗更易被临床所接受，是从噬菌体中提取的一类新型抗菌药物。内溶素在噬菌体复制过程中表达，它可以破坏细菌细胞壁肽聚糖的关键化学键，由于肽聚糖是细菌细胞壁的主要结构成分，细菌细胞壁肽聚糖层的破坏将导致细菌的溶解和细胞的死亡，使得子代噬菌体得以释放，以此来发挥抗菌活性。
[0005]内溶素成为抑制病原性菌株感染的新兴手段，其优势在于具有抗生素不具备的优点。噬菌体内溶素不易产生耐药性，来源广泛，在体内体外对革兰氏阳性菌具有良好的抗菌作用，具有良好的生物安全性和较高的种属特异性。将内溶素作为抗菌剂使用时，革兰氏阴性菌的外膜结构会阻碍裂解酶与细菌细胞壁进行结合，导致内溶素难以对革兰氏阴性菌进行有效杀灭。因此需要使用分子生物学的方法对天然内溶素进行设计改造，增强内溶素的裂解活性和宿主谱，使其成为优良的抗菌试剂。

技术实现思路

[0006]本专利技术的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种抗大肠杆菌的噬菌体内溶素。
[0007]本专利技术的另一目的在于提供一种抗大肠杆菌的噬菌体内溶素的制备方法。
[0008]本专利技术的再一目的在于提供所述的抗大肠杆菌的噬菌体内溶素的应用。
[0009]本专利技术的目的通过下述技术方案实现：
[0010]一种抗大肠杆菌的噬菌体内溶素，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
[0011]编码所述抗大肠杆菌的噬菌体内溶素的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
[0012]一种重组表达载体，含有编码上述抗大肠杆菌的噬菌体内溶素的基因，即通过将编码上述抗大肠杆菌的噬菌体内溶素的基因克隆进入表达载体获得。
[0013]所述的表达载体为PET系列载体；优选为pET
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9a、pET
‑
28a(+)、pET
‑
22b(+)、pET
‑
26b(+)或pET
‑
31b(+)载体；进一步优选为pET28a(+)载体。
[0014]所述的将编码上述抗大肠杆菌的噬菌体内溶素的基因克隆进入表达载体优选通过酶切位点HindⅢ和SalI插入pET28a(+)中。
[0015]一种重组表达菌株，含有上述重组表达载体，即通过将上述重组表达载体转入宿主菌株获得。
[0016]所述的宿主菌株为细菌、酵母或真菌；优选为细菌；进一步优选为大肠杆菌(Escherichia coli)；最优选为大肠杆菌BL21(DE3)。
[0017]一种抗大肠杆菌的噬菌体内溶素(蛋白)的制备方法，包括如下步骤：
[0018](1)将编码上述抗大肠杆菌的噬菌体内溶素的基因克隆进入表达载体，得到重组表达载体；
[0019](2)将重组表达载体转入宿主菌株，得到重组表达菌株；
[0020](3)将重组表达菌株先进行培养，再诱导表达，离心收集菌液，分离纯化，得到抗大肠杆菌的噬菌体内溶素。
[0021]步骤(1)中所述的表达载体为pET系列载体；优选为pET
‑
3a、pET
‑
9a、pET
‑
28a(+)、pET
‑
22b(+)、pET
‑
26b(+)或pET
‑
31b(+)载体；进一步优选为pET28a(+)载体。
[0022]步骤(2)中所述的宿主菌株为细菌、酵母或真菌；优选为细菌；进一步优选为大肠杆菌(Escherichia coli)；最优选为大肠杆菌BL21(DE3)。
[0023]步骤(3)中所述的培养的条件为：37℃、200rpm培养至菌液OD600为0.6～0.8(优选为OD600＝0.8)。
[0024]步骤(3)中所述的诱导表达的诱导剂优选为IPTG(异丙基
‑
β
‑
D
‑
硫代半乳糖苷)。
[0025]所述的IPTG的用量为按其在诱导体系的终浓度为0.1mmol/L添加计算。
[0026]步骤(3)中所述的诱导表达的条件优选为：37℃诱导4h以上。
[0027]步骤(3)中所述的离心的条件优选为：8000rpm离心10min。
[0028]步骤(3)中所述的分离纯化优选为采用镍柱亲和层析法进行分离纯化。
[0029]所述的抗大肠杆菌的噬菌体内溶素在制备抑菌剂(抗菌剂)中的应用。
[0030]所述的抑菌剂中的菌为革兰氏阴性菌；优选为大肠杆菌；进一步优选为致病性大肠杆菌。
[0031]本专利技术相对于现有技术具有如下的优点及效果：
[0032](1)鉴于大肠杆菌血清型的多样性及各个血清型之间的交叉免疫性差，疫苗难于发挥作用，另有抗生素的滥用导致细菌的耐药株的出现，可通过噬菌体疗法裂解宿主细菌，本专利技术通过基因工程的方法，将目的基因即编码抗大肠杆菌的噬菌体内溶素蛋白的基因构建到表达载体(优选pET
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28a(+))上，对质粒进行信号肽的删除及其他修饰处理，确保转化和蛋白表达的顺利进行，然后将重组表达载体转入宿主菌株诱导表达获得噬菌体内溶素蛋
白，该噬菌体内溶素蛋白对大肠杆菌具有一定杀菌作用。
[0033](2)本专利技术所构建的带有目的基因的质粒，通过原核表达获得大量目的蛋白，利于将该噬菌体内溶素应用于生产和实践当中，有本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种抗大肠杆菌的噬菌体内溶素，其特征在于：其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。2.编码权利要求1所述的抗大肠杆菌的噬菌体内溶素的基因，其特征在于：其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。3.一种重组表达载体，其特征在于：含有编码权利要求1所述的抗大肠杆菌的噬菌体内溶素的基因。4.一种重组表达菌株，其特征在于：含有权利要求3所述的重组表达载体。5.一种抗大肠杆菌的噬菌体内溶素的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)将编码权利要求1所述的抗大肠杆菌的噬菌体内溶素的基因克隆进入表达载体，得到重组表达载体；(2)将重组表达载体转入宿主菌株，得到重组表达菌株；(3)将重组表达菌株先进行培养，再诱导表达，离心收集菌液，分离纯化，得到抗大肠杆菌的噬菌体内溶素。6.根据权利要求5所述的抗大肠杆菌的噬菌体内溶素的制备方法，其特征在于：步骤(1)中所述的表达载体为pET载体；步骤(2)中所述的宿主菌株为细菌、酵母或真菌；步骤(3)中所述的诱导表...

【专利技术属性】
技术研发人员：董心迎，刘珮琪，谢倩梅，李伟业，曹雪薇，黄秀琴，江金飞，代绘琳，罗开健，冯赛祥，
申请(专利权)人：华南农业大学，
类型：发明
国别省市：