β-甘露聚糖酶突变体食品级枯草芽孢杆菌表达载体、表达系统、构建方法和应用技术方案

本发明专利技术对地衣芽孢杆菌β

\u03b2- Mannanase mutant food grade Bacillus subtilis expression vector, expression system, construction method and Application

【技术实现步骤摘要】
β
‑
甘露聚糖酶突变体食品级枯草芽孢杆菌表达载体、表达系统、构建方法和应用


[0001]本专利技术涉及一种β
‑
甘露聚糖酶突变体食品级枯草芽孢杆菌表达载体、表达系统、构建方法和应用。

技术介绍

[0002]枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，具备生物安全性好(GRAS)、分子操作便利、遗传稳定性高、蛋白分泌能力强、培养鲁棒、发酵友好等诸多优点，被工业界广泛采用。1997年B.subtilis的完整基因组公布，随后其转录组、分泌蛋白质组、代谢及遗传调控网络等陆续得以深入研究和公开，在这些基础性研究工作的支撑下，B.subtilis成为优良底盘细胞的基础条件趋向成熟。
[0003]β
‑
甘露聚糖酶(EC 3.2.1.78)，是能够水解β
‑
1,4甘露糖苷键的内切水解酶，其水解产物为甘露寡糖(MOS)，MOS具有促进肠道益生菌、抑制病源微生物的繁殖及增强免疫能力等功效，作为功能性食品用于医药领域。中国专利CN112410322A公开了一种地衣芽孢杆菌β
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甘露聚糖酶突变体，并利用枯草芽孢杆菌实现了其高效分泌表达。
[0004]目前，基因工程中常利用抗生素作为筛选标记，由于抗生素潜在的危害，限制了枯草芽孢杆菌等工程菌株所表达的外源蛋白或小分子代谢产物在医疗、食品、饲料等工业领域中的应用。食品级表达系统则可避免抗生素残留造成的危害，受到越来越多研究者的青睐。食品级表达系统要求满足2个条件，一是宿主菌来源应为食品安全的微生物，二是不能利用抗生素作为筛选标记。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的是提供可实现高酶活性及稳定性的地衣芽孢杆菌β
‑
甘露聚糖酶突变体进行枯草芽孢杆菌食品级的表达载体、表达系统、构建方法以及应用并利用该酶制备甘露寡糖。
[0006]本专利技术采用如下技术方案：
[0007]一种β
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甘露聚糖酶突变体食品级枯草芽孢杆菌表达载体，在包含地衣芽孢杆菌β
‑
甘露聚糖酶突变体编码基因的枯草芽孢杆菌表达载体上，用枯草芽孢杆菌d
‑
丙氨酸消旋酶基因(dal基因)替换抗生素抗性基因片段。
[0008]其中，所述抗生素抗性基因包括卡那霉素抗性基因和博来霉素抗性基因。
[0009]其中，所述β
‑
甘露聚糖酶突变体为ManBl(I91N/L211I)，编码基因的核苷酸序列如中国专利CN112410322A中公开的SEQ ID No.2所示。
[0010]一种上述β
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甘露聚糖酶突变体食品级枯草芽孢杆菌表达载体的构建方法，其包括如下步骤：
[0011](1)包含地衣芽孢杆菌β
‑
甘露聚糖酶突变体编码基因的枯草芽孢杆菌表达载体为模板，扩增不包含抗生素抗性基因的片段；
[0012](2)以枯草芽孢杆菌基因组为模板，扩增枯草芽孢杆菌d
‑
丙氨酸消旋酶基因的片段；
[0013](3)将步骤(1)和步骤(2)获得的片段进行连接。
[0014]其中，所述枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌DB104。
[0015]其中，步骤(3)使用重叠延伸PCR(POE
‑
PCR)进行连接。
[0016]一种利用上述β
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甘露聚糖酶突变体食品级枯草芽孢杆菌表达载体的表达系统，其为敲除了枯草芽孢杆菌d
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丙氨酸消旋酶基因构建的枯草芽孢杆菌食品级表达宿主细胞，所述枯草芽孢杆菌食品级表达宿主细胞内包含β
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甘露聚糖酶突变体食品级枯草芽孢杆菌表达载体。
[0017]一种上述β
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甘露聚糖酶突变体食品级枯草芽孢杆菌表达系统的构建方法，其包括如下步骤：
[0018](a)构建用于敲除枯草芽孢杆菌d
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丙氨酸消旋酶基因的质粒；
[0019](b)使用步骤(a)得到的质粒，利用CRISPR/Cpf1方法，构建枯草芽孢杆菌食品级表达宿主细胞；
[0020](c)使用β
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甘露聚糖酶突变体食品级枯草芽孢杆菌表达载体转化至步骤(b)构建的枯草芽孢杆菌食品级表达宿主细胞。
[0021]一种上述β
‑
甘露聚糖酶突变体食品级枯草芽孢杆菌表达系统在制备甘露寡糖中的应用。
[0022]一种上述β
‑
甘露聚糖酶突变体食品级枯草芽孢杆菌表达系统在制备用于医疗、食品或饲料的甘露寡糖中的应用。
[0023]本专利技术的有益效果在于：本专利技术通过表达载体和表达系统的构建，实现了β
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甘露聚糖酶突变体的食品级表达。该表达系统制备的β
‑
甘露聚糖酶突变体符合食品级表达的要求，即所使用的宿主枯草芽孢杆菌为食品安全的GRAS菌种，无抗生素筛选标记，可用于制备医疗、食品、饲料等工业领域使用的甘露寡糖。
附图说明
[0024]图1为pcrF11质粒酶切结果
[0025]图1中泳道M为DNA Marker；泳道1为pcrF11质粒单酶切结果。
[0026]图2为dal基因上下游同源臂片段扩增结果
[0027]图2中泳道M为DNA Marker；泳道1为dal基因上游同源臂片段扩增结果；泳道2为dal基因下游同源臂片段扩增结果。
[0028]图3为SOE
‑
PCR扩增结果
[0029]图3中泳道M为DNA Marker；泳道1为SOE
‑
PC扩增结果。
[0030]图4为pcrF11
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dal1质粒双酶切结果
[0031]图4中泳道M为DNA Marker；泳道1为pcrF11
‑
dal1质粒双酶切结果。
[0032]图5为食品级表达宿主B.subtilis DBFG
‑
1分子鉴定结果
[0033]图5中泳道M为DNA Marker；泳道1
‑
15，17
‑
22：枯草芽孢杆菌食品级表达宿主菌落PCR扩增产物；泳道16：同源臂片段扩增结果；泳道23：DB104菌落PCR扩增结果。
[0034]图6为pWB
‑
manBl(I91N/L211I)载体无抗生素片段扩增结果
[0035]图6中泳道M为DNA Marker；泳道1为载体扩增结果。
[0036]图7为枯草芽孢杆菌dal基因扩增结果
[0037]图7中泳道M为DNA Marker；泳道1为dal基因扩增结果。
[0038]图8为POE
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PCR扩增结果
[0039]图8中泳道M为DNA Marker；泳道1
‑
3为POE
‑
PCR扩增结果。
[0040]图9为pWB<本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种β
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甘露聚糖酶突变体食品级枯草芽孢杆菌表达载体，其特征在于，在包含地衣芽孢杆菌β
‑
甘露聚糖酶突变体编码基因的枯草芽孢杆菌表达载体上，用枯草芽孢杆菌d
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丙氨酸消旋酶基因替换抗生素抗性基因片段。2.根据权利要求1所述的β
‑
甘露聚糖酶突变体食品级枯草芽孢杆菌表达载体，其特征在于，所述抗生素抗性基因包括卡那霉素抗性基因和博来霉素抗性基因。3.根据权利要求1所述的β
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甘露聚糖酶突变体食品级枯草芽孢杆菌表达载体，其特征在于，所述β
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甘露聚糖酶突变体为ManBl(I91N/L211I)。4.一种如权利要求1所述的β
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甘露聚糖酶突变体食品级枯草芽孢杆菌表达载体的构建方法，其特征在于，其包括如下步骤：(1)包含地衣芽孢杆菌β
‑
甘露聚糖酶突变体编码基因的枯草芽孢杆菌表达载体为模板，扩增不包含抗生素抗性基因的片段；(2)以枯草芽孢杆菌基因组为模板，扩增枯草芽孢杆菌d
‑
丙氨酸消...

【专利技术属性】
技术研发人员：张春晓，王丽丽，陈赟，刘金龙，梁琪，
申请(专利权)人：河北科技大学，
类型：发明
国别省市：