EGFR抗原结合片段和包含它们的组合物制造技术

本公开涉及特异性地结合EGFR或其表位的抗原结合单元。一些实施方案包括具有改善的表达和/或稳定性的双特异性抗EGFR/抗CD3构建体。还公开了相关的方法。体。还公开了相关的方法。体。还公开了相关的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】EGFR抗原结合片段和包含它们的组合物
[0001]交叉参考
[0002]本申请要求保护2019年6月26日提交的美国临时申请第62/866,749号和2020年6月24日提交的美国临时申请第63/043,486号的权益，这两篇申请通过引用整体并入本文。
[0003]序列表
[0004]本申请含有序列表，其已经以ASCII格式电子提交，且特此通过引用整体并入。所述ASCII副本创建于2020年6月25日，名称为32808
‑
779_601_SL.txt，并且是2,131,102个字节大小。
[0005]专利技术背景
[0006]许多经批准的癌症治疗剂是杀伤正常细胞以及肿瘤细胞的细胞毒性药物。这些细胞毒性药物的治疗益处取决于肿瘤细胞比正常细胞更敏感，从而允许使用不导致无法接受的副作用的剂量来实现临床响应。但是，基本上所有这些非特异性药物都会对正常组织造成一些(如果不严重的话)损害，这经常限制治疗适合性。
[0007]双特异性抗体可以通过指导免疫效应细胞杀伤癌细胞来提供细胞毒性药物的不同方法。双特异性抗体将源自两种单克隆抗体的不同结合特异性的益处组合到单一组合物中，能实现用单特异性抗体不可能实现的覆盖的方法或组合。在一种实施方案中，该方法依赖于双特异性抗体的一个臂与肿瘤相关的抗原或标志物的结合，而另一个臂在结合T细胞上的CD3分子时，通过释放效应分子诸如TNF
‑
α、IFN
‑
γ、白介素2、4和10、穿孔蛋白和颗粒酶，触发其细胞毒性活性。抗体工程的进展已经导致用于将效应细胞重定向至肿瘤靶标的许多双特异性抗体形式和组合物的开发，包括通过在肿瘤部位募集和活化T细胞的多克隆群体而起作用的双特异性抗体，并且这样做不需要共刺激或常规MHC识别。但是，仍存在双重问题，即，某些患者经历被称作“细胞因子风暴(cytokine storm)”或“细胞因子释放综合征”的严重副作用(Lee DW等人Current concepts in the diagnosis and management of cytokine release syndrome.Blood.2014 124(2):188
‑
195)，其由TNF
‑
α和IFN
‑
γ以及其它细胞因子的释放介导，此外，事实上一些双特异性组合物具有非常短的半衰期(为了在治疗窗内维持循环浓度足以达到治疗效果的时间而需要连续输注四至八周)或具有可变的效果。因此，在开发用于癌症治疗的有效双特异性抗体的领域存在未得到满足的需求。
[0008]专利技术概述
[0009]本专利技术涉及掺入嵌合融合蛋白中的抗表皮生长因子受体(EGFR)抗原结合片段及其使用方法或制备方法。在一个方面，本文公开了包含抗原结合片段(AF1)的多肽，其中所述AF1包含轻链互补决定区(CDR
‑
L)、重链互补决定区(CDR
‑
H)、轻链框架区(FR
‑
L)和重链框架区(FR
‑
H)，并且其中所述AF1：a.特异性地结合表皮生长因子受体(EGFR)；和b.包含FR
‑
H1、FR
‑
H2、FR
‑
H3和FR
‑
H4，其中FR
‑
H1具有SEQ ID NO:14
‑
16中的任一个的氨基酸序列，FR
‑
H2具有SEQ ID NO:18或SEQ ID NO:19的氨基酸序列，FR
‑
H3具有SEQ ID NO:20或SEQ ID NO:21的氨基酸序列，并且FR
‑
H4具有SEQ ID NO:22
‑
24中的任一个的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述AF1包含与SEQ ID NO:37
‑
51中的任一个的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％的序列同一性或与其相同的氨基酸序列。在某些实施方案中，AF1是嵌合或
人源化抗原结合片段。在一种实施方案中，所述AF1选自由Fv、Fab、Fab
′
、Fab
′‑
SH、线性抗体和单链可变片段(scFv)组成的组。
[0010]在另一种实施方案中，所述AF1包含与SEQ ID NO:28
‑
32的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的序列同一性或与其相同的可变重链(VH)氨基酸序列。在某些实施方案中，所述AF1包含与SEQ ID NO:25
‑
27的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的序列同一性或与其相同的可变轻链(VL)氨基酸序列。
[0011]在一些实施方案中，AF1还包含CDR
‑
H3，其中CDRH3具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列。在某些实施方案中，所述AF1还包含分别具有SEQ ID NO:4、5和6的氨基酸序列的CDR
‑
H1、CDR
‑
H2和CDR
‑
H3。在某些实施方案中，所述AF1 CDR
‑
L包含分别包含SEQ ID NO:1、2和3的氨基酸序列的CDR
‑
L1、CDR
‑
L2和CDR
‑
L3。
[0012]在其它实施方案中，AF1还包含FR
‑
L，其包含FR
‑
L1、FR
‑
L2、FR
‑
L3和FR
‑
L4，其中a.FR
‑
L1表现出与SEQ ID NO:7的氨基酸序列至少90％、或至少95％的序列同一性或与其相同；b.FR
‑
L2表现出与SEQ ID NO:8的氨基酸序列至少90％、或至少95％的序列同一性或与其相同；c.FR
‑
L3表现出与SEQ ID NO:9
‑
11的氨基酸序列至少90％、或至少95％的序列同一性或与其相同；以及d.FR
‑
L4表现出与SEQ ID NO:13的氨基酸序列至少90％、或至少95％的序列同一性或与其相同。在某些实施方案中，所述FR
‑
L包含：a.具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的FR
‑
L1，b.具有SEQ ID NO:8的氨基酸序列的FR
‑
L2，c.具有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的FR
‑
L3，d.具有SEQ ID NO:13的氨基酸序列的FR
‑
L4。在另一种实施方案中，所述FR
‑
L包含：a.具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的FR
‑
L1，b.具有SEQ ID NO:8的氨本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种多肽，所述多肽包含抗原结合片段(AF1)，其中所述AF1包含轻链互补决定区(CDR
‑
L)、重链互补决定区(CDR
‑
H)、轻链框架区(FR
‑
L)和重链框架区(FR
‑
H)，并且其中所述AF1：a.特异性地结合表皮生长因子受体(EGFR)；并且b.包含FR
‑
H1、FR
‑
H2、FR
‑
H3和FR
‑
H4，其中FR
‑
H1具有SEQ ID NO:14
‑
16中的任一个的氨基酸序列，FR
‑
H2具有SEQ ID NO:18或SEQ ID NO:19的氨基酸序列，FR
‑
H3具有SEQ ID NO:20或SEQ ID NO:21的氨基酸序列，FR
‑
H4具有SEQ ID NO:22
‑
24中的任一个的氨基酸序列。2.根据权利要求1所述的多肽，其中所述AF1还包含CDR
‑
H3，其中所述CDR
‑
H3具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列。3.根据权利要求1或权利要求2所述的多肽，其中所述AF1还包含分别具有SEQ ID NO:4、5和6的氨基酸序列的CDR
‑
H1、CDR
‑
H2和CDR
‑
H3。4.根据权利要求1
‑
3中任一项所述的多肽，其中所述AF1相对于由SEQ ID NO:52中所示的序列组成的抗原结合片段具有更高的等电点(pI)。5.根据权利要求1
‑
4中任一项所述的多肽，其中所述AF1掺入所述多肽中以形成抗EGFR双特异性抗体，所述多肽相对于对照双特异性抗体表现出更高的pI，其中所述多肽包含所述AF1和结合T细胞受体分化簇3(CD3)的参考抗原结合片段，并且其中除所述AF1被SEQ ID NO:52替代之外，所述对照双特异性抗原结合片段与所述多肽相同。6.根据权利要求4或权利要求5所述的多肽，其中所述AF1表现出比由SEQ ID NO:52中所示序列组成的抗原结合片段的pI高至少0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或1.0pH单位的pI。7.根据前述权利要求中任一项所述的多肽，其中所述AF1还包含FR
‑
L1、FR
‑
L2、FR
‑
L3和FR
‑
L4，其中a.FR
‑
L1表现出与SEQ ID NO:7的氨基酸序列至少90％、或至少95％的序列同一性或与其相同；b.FR
‑
L2表现出与SEQ ID NO:8的氨基酸序列至少90％、或至少95％的序列同一性或与其相同；c.FR
‑
L3表现出与SEQ ID NO:9
‑
11的氨基酸序列至少90％、或至少95％的序列同一性或与其相同；并且d.FR
‑
L4表现出与SEQ ID NO:13的氨基酸序列至少90％、或至少95％的序列同一性或与其相同。8.根据前述权利要求中任一项所述的多肽，其中所述AF1 CDR
‑
L包含分别包含SEQ ID NO:1、2和3的氨基酸序列的CDR
‑
L1、CDR
‑
L2和CDR
‑
L3。9.根据前述权利要求中任一项所述的多肽，其中所述FR
‑
L包含：a.具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的FR
‑
L1，b.具有SEQ ID NO:8的氨基酸序列的FR
‑
L2，c.具有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的FR
‑
L3，d.具有SEQ ID NO:13的氨基酸序列的FR
‑
L4。10.根据权利要求1
‑
8中任一项所述的多肽，其中所述FR
‑
L包含：a.具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的FR
‑
L1，
b.具有SEQ ID NO:8的氨基酸序列的FR
‑
L2，c.具有SEQ ID NO:10的氨基酸序列的FR
‑
L3，d.具有SEQ ID NO:13的氨基酸序列的FR
‑
L4。11.根据权利要求1
‑
8的多肽，其中所述FR
‑
L包含：a.具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的FR
‑
L1，b.具有SEQ ID NO:8的氨基酸序列的FR
‑
L2，c.具有SEQ ID NO:11的氨基酸序列的FR
‑
L3，和d.具有SEQ ID NO:13的氨基酸序列的FR
‑
L4。12.根据权利要求1
‑
11中任一项所述的多肽，其中所述FR
‑
H包含：a.具有SEQ ID NO:14的氨基酸序列的FR
‑
H1，b.具有SEQ ID NO:18的氨基酸序列的FR
‑
H2，c.具有SEQ ID NO:20的氨基酸序列的FR
‑
H3，d.具有SEQ ID NO:22或23的氨基酸序列的FR
‑
H4。13.根据权利要求1
‑
11中任一项所述的多肽，其中所述FR
‑
H包含：a.具有SEQ ID NO:15的氨基酸序列的FR
‑
H1，b.具有SEQ ID NO:19的氨基酸序列的FR
‑
H2，c.具有SEQ ID NO:21的氨基酸序列的FR
‑
H3，d.具有SEQ ID NO:24的氨基酸序列的FR
‑
H4。14.根据权利要求1
‑
11中任一项所述的多肽，其中所述FR
‑
H包含：a.具有SEQ ID NO:16的氨基酸序列的FR
‑
H1，b.具有SEQ ID NO:19的氨基酸序列的FR
‑
H2，c.具有SEQ ID NO:20的氨基酸序列的FR
‑
H3，d.具有SEQ ID NO:22或23的氨基酸序列的FR
‑
H4。15.根据前述权利要求中任一项所述的多肽，其中所述AF1包含与SEQ ID NO:28
‑
32的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的序列同一性或与其相同的可变重链(VH)氨基酸序列。16.根据前述权利要求中任一项所述的多肽，其中所述AF1包含与SEQ ID NO:25
‑
27的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的序列同一性或与其相同的可变轻链(VL)氨基酸序列。17.根据前述权利要求中任一项所述的多肽，其中所述AF1包含与SEQ ID NO:37
‑
51中的任一个的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％的序列同一性或与其相同的氨基酸序列。18.根据前述权利要求中任一项所述的多肽，其中所述AF1特异性地结合人或食蟹猴(cyno)EGFR。19.根据前述权利要求中任一项所述的多肽，其中所述AF1特异性地结合人和食蟹猴(cyno)EGFR。20.根据前述权利要求中任一项所述的多肽，其中所述AF1表现出的pI为约5.4至约5.6、或约5.5至约5.7、或约5.6至约5.8、或约5.7至约5.9、或约5.8至约6.0、或约5.9至约6.1、或约6.0至约6.2、或约6.1至约6.3、或约6.2至约6.4、或约6.3至约6.5、或约6.4至约
6.6。21.根据前述权利要求中任一项所述的多肽，其中所述AF1表现出的pI为约5.4、或约5.5、或约5.6、或约5.7、或约5.8、或约5.9、或约6.0、或约6.1、或约6.2、或约6.3、或约6.4、或约6.5、或约6.6。22.根据前述权利要求中任一项所述的多肽，其中所述AF1表现出在5.4和6.6之间、包括端点的pI。23.根据前述权利要求中任一项所述的多肽，其中所述AF1以在约0.1nM和约100nM之间的K
d
特异性地结合EGFR，如在包含EGFR或其表位的体外抗原结合测定中所确定的。24.根据前述权利要求中任一项所述的多肽，其中相对于SEQ ID NO:52的氨基酸序列，所述AF1在框架区中具有对疏水性氨基酸的至少一个氨基酸取代，其中所述疏水性氨基酸选自异亮氨酸、亮氨酸或甲硫氨酸，并且取代氨基酸选自精氨酸、苏氨酸或谷氨酰胺。25.根据权利要求24所述的多肽，其中相对于SEQ ID NO:52的氨基酸序列，所述AF1在一个或更多个框架区中具有对疏水性氨基酸的至少两个氨基酸取代，其中所述疏水性氨基酸选自异亮氨酸、亮氨酸或甲硫氨酸，并且所述取代氨基酸选自精氨酸、苏氨酸或谷氨酰胺。26.根据前述权利要求中任一项所述的多肽，所述多肽还包含第一释放区段肽(RS1)，其中所述RS1是用于被哺乳动物蛋白酶切割的底物。27.根据前述权利要求中任一项所述的多肽，其中所述RS1是选自由豆荚蛋白、MMP
‑
2、MMP
‑
7、MMP
‑
9、MMP
‑
11、MMP
‑
14、uPA和间质蛋白酶组成的组的蛋白酶的底物。28.根据前述权利要求中任一项所述的多肽，其中所述RS1包含与选自SEQ ID NO:53
‑
671中任一个的序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列。29.根据前述权利要求中任一项所述的多肽，其中所述RS1包含选自RSR
‑
2089、RSR
‑
2295、RSR
‑
2298、RSR
‑
2488、RSR
‑
2599、RSR
‑
2485、RSR
‑
2486、RSR
‑
2728、RSN
‑
2089、RSN
‑
2295、RSN
‑
2298、RSN
‑
2488、RSN
‑
2599、RSN
‑
2485、RSN
‑
2486、RSN
‑
2728、RSC
‑
2089、RSC
‑
2295、RSC
‑
2298、RSC
‑
2488、RSC
‑
2599、RSC
‑
2485、RSC
‑
2486和RSC
‑
2728的序列的氨基酸序列，其中每个在表5中示出。30.根据前述权利要求中任一项所述的多肽，所述多肽还包含第一延长重组多肽(XTEN1)，其中所述XTEN1的特征在于a.它具有至少约36个氨基酸；b.所述XTEN1序列的至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸残基选自甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、谷氨酸(E)和脯氨酸(P)；和c.它具有至少4
‑
6种不同的选自G、A、S、T、E和P的氨基酸。31.根据前述权利要求中任一项所述的多肽，其中所述XTEN1包含含有SEQ ID NO:672
‑
675的氨基酸序列中的至少三个的氨基酸序列。32.根据前述权利要求中任一项所述的多肽，其中所述XTEN1包含与选自SEQ ID NO:676
‑
734中的任一个的序列具有至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列。
33.根据前述权利要求中任一项所述的多肽，其中所述XTEN1包含与选自以下序列的序列具有至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列：AE144_1A、AE144_2A、AE144_2B、AE144_3A、AE144_3B、AE144_4A、AE144_4B、AE144_5A、AE144_6B、AE144_7A、AE284、AE288_1、AE288_2、AE288_3、AE292、AE293、AE300、AE576、AE584、AE864、AE864_2、AE865、AE866、AE867和AE868，其中每个在表7中示出。34.根据前述权利要求中任一项所述的多肽，其中所述AF1是嵌合或人源化抗原结合片段。35.根据前述权利要求中任一项所述的多肽，其中所述AF1选自由Fv、Fab、Fab'、Fab'
‑
SH、线性抗体和单链可变片段(scFv)组成的组。36.根据前述权利要求中任一项所述的多肽，所述多肽表达为融合蛋白，其中处于未切割状态的所述融合蛋白具有AF1
‑
RS1
‑
XTEN1或XTEN1
‑
RS1
‑
AF1的从N
‑
端至C
‑
端的结构排列。37.根据前述权利要求中任一项所述的多肽，所述多肽还包含特异性地结合分化簇3T细胞受体(CD3)的第二抗原结合片段(AF2)。38.根据权利要求37的多肽，其中所述AF2结合选自CD3ε、CD3δ、CD3γ、CD3δ、CD3α和CD3βε中任一种的CD3复合物亚基。39.根据权利要求37或权利要求38所述的多肽，其中所述AF2特异性地结合人或食蟹猴(cyno)CD3。40.根据权利要求37或权利要求38所述的多肽，其中所述AF2特异性地结合人和食蟹猴(cyno)CD3。41.根据权利要求37
‑
40中任一项所述的多肽，其中所述AF2包含轻链互补决定区(CDR
‑
L)和重链互补决定区(CDR
‑
H)，并且其中所述AF2包含分别具有SEQ ID NO:742、743和744的氨基酸序列的CDR
‑
H1、CDR
‑
H2和CDR
‑
H3。42.根据权利要求41所述的多肽，其中所述CDR
‑
L包含：a.具有SEQ ID NO:735或736的氨基酸序列的CDR
‑
L1，b.具有SEQ ID NO:738或739的氨基酸序列的CDR
‑
L2，和c.具有SEQ ID NO:740的氨基酸序列的CDR
‑
L3。43.根据权利要求41或权利要求42的多肽，其中所述AF2还包含轻链框架区(FR
‑
L)和重链框架区(FR
‑
H)，其中AF2包含：a.具有SEQ ID NO:746的氨基酸序列的FR
‑
L1；b.具有SEQ ID NO:747的氨基酸序列的FR
‑
L2；c.具有SEQ ID NO:748
‑
751中的任一个的氨基酸序列的FR
‑
L3；d.具有SEQ ID NO:754的氨基酸序列的FR
‑
L4；e.具有SEQ ID NO:755或SEQ ID NO:756的氨基酸序列的FR
‑
H1；f.具有SEQ ID NO:759的氨基酸序列的FR
‑
H2；g.具有SEQ ID NO:760的氨基酸序列的FR
‑
H3；以及h.具有SEQ ID NO:764的氨基酸序列的FR
‑
H4。44.根据权利要求41
‑
43中任一项所述的多肽，其中所述AF2还包含轻链框架区(FR
‑
L)和重链框架区(FR
‑
H)，并且其中所述抗原结合片段包含：a.具有SEQ ID NO:746的氨基酸序列的FR
‑
L1；
b.具有SEQ ID NO:747的氨基酸序列的FR
‑
L2；c.具有SEQ ID NO:748的氨基酸序列的FR
‑
L3；d.具有SEQ ID NO:754的氨基酸序列的FR
‑
L4；e.具有SEQ ID NO:755的氨基酸序列的FR
‑
H1；f.具有SEQ ID NO:759的氨基酸序列的FR
‑
H2；g.具有SEQ ID NO:760的氨基酸序列的FR
‑
H3；以及h.具有SEQ ID NO:764的氨基酸序列的FR
‑
H4。45.根据权利要求41
‑
43中任一项所述的多肽，其中所述AF2还包含轻链框架区(FR
‑
L)和重链框架区(FR
‑
H)，并且其中所述抗原结合片段包含：a.具有SEQ ID NO:746的氨基酸序列的FR
‑
L1；b.具有SEQ ID NO:747的氨基酸序列的FR
‑
L2；c.具有SEQ ID NO:749的氨基酸序列的FR
‑
L3；d.具有SEQ ID NO:754的氨基酸序列的FR
‑
L4；e.具有SEQ ID NO:756的氨基酸序列的FR
‑
H1；f.具有SEQ ID NO:759的氨基酸序列的FR
‑
H2；g.具有SEQ ID NO:760的氨基酸序列的FR
‑
H3；以及h.具有SEQ ID NO:764的氨基酸序列的FR
‑
H4。46.根据权利要求41
‑
43中任一项所述的多肽，其中所述AF2还包含轻链框架区(FR
‑
L)和重链框架区(FR
‑
H)，并且其中所述抗原结合片段包含：a.具有SEQ ID NO:746的氨基酸序列的FR
‑
L1；b.具有SEQ ID NO:747的氨基酸序列的FR
‑
L2；c.具有SEQ ID NO:750的氨基酸序列的FR
‑
L3；d.具有SEQ ID NO:754的氨基酸序列的FR
‑
L4；e.具有SEQ ID NO:756的氨基酸序列的FR
‑
H1；f.具有SEQ ID NO:759的氨基酸序列的FR
‑
H2；g.具有SEQ ID NO:760的氨基酸序列的FR
‑
H3；以及h.具有SEQ ID NO:764的氨基酸序列的FR
‑
H4。47.根据权利要求41
‑
43中任一项所述的多肽，其中所述AF2还包含轻链框架区(FR
‑
L)和重链框架区(FR
‑
H)，并且其中所述抗原结合片段包含：a.具有SEQ ID NO:746的氨基酸序列的FR
‑
L1；b.具有SEQ ID NO:747的氨基酸序列的FR
‑
L2；c.具有SEQ ID NO:751的氨基酸序列的FR
‑
L3；d.具有SEQ ID NO:754的氨基酸序列的FR
‑
L4；e.具有SEQ ID NO:756的氨基酸序列的FR
‑
H1；f.具有SEQ ID NO:759的氨基酸序列的FR
‑
H2；g.具有SEQ ID NO:760的氨基酸序列的FR
‑
H3；以及h.具有SEQ ID NO:764的氨基酸序列的FR
‑
H4。48.根据权利要求37
‑
47所述的多肽，其中所述AF2包含与SEQ ID NO:766或SEQ ID NO:769的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的序
列同一性或与其相同的可变重链(VH)氨基酸序列。49.根据权利要求37
‑
48中任一项所述的多肽，其中所述AF2包含与SEQ ID NO:765、767、768、770或771中的任一个的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的序列同一性或与其相同的可变轻链(VL)氨基酸序列。50.根据权利要求37
‑
49中任一项所述的多肽，其中所述AF2包含与SEQ ID NO:776
‑
780中的任一个的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％的序列同一性或与其相同的氨基酸序列。51.根据权利要求37
‑
50中任一项所述的多肽，其中所述AF2的T
m
比由SEQ ID:781的序列组成的抗原结合片段的T
m
高至少2℃、或高至少3℃、或高至少4℃、或高至少5℃、或高至少6℃、或高至少7℃、或高至少8℃、或高至少9℃、或高至少10℃，如通过在体外测定中解链温度的增加所确定的。52.根据权利要求37至51中任一项所述的多肽，其中所述AF2以约10nM和约400nM之间的解离常数(K
d
)特异性地结合人或食蟹猴CD3，如在体外抗原结合测定中所确定的。53.根据权利要求37至52中任一项所述的多肽，其中所述AF2以约10nM和约400nM之间，或约50nM和约350nM之间，或约100nM和300nM之间的解离常数(K
d
)特异性地结合人或食蟹猴CD3，如在体外抗原结合测定中所确定的。54.根据权利要求37
‑
52中任一项所述的多肽，其中所述AF2以小于约3nM、或约10nM、或约50nM、或约100nM、或约150nM、或约200nM、或约250nM、或约300nM、或约400nM的解离常数(K
d
)特异性地结合人或食蟹猴CD3，如在体外抗原结合测定中所确定的。55.根据权利要求37
‑
54中任一项所述的多肽，其中所述AF2以比由SEQ ID NO:781的氨基酸序列组成的抗原结合片段低至少2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍或至少10倍的结合亲和力特异性地结合人或食蟹猴CD3，如通过体外抗原结合测定中的各自解离常数(K
d
)所确定的。56.根据权利要求37
‑
55中任一项所述的多肽，其中所述AF2通过柔性肽接头与所述AF1融合。57.根据权利要求56的所述多肽，其中所述柔性接头包含2或3类选自由甘氨酸、丝氨酸和脯氨酸组成的组的氨基酸。58.根据权利要求37
‑
57中任一项所述的多肽，其中(1)所述AF2片段选自由Fv、Fab、Fab'、Fab'
‑
SH、线性抗体、单结构域抗体和单链可变片段(scFv)组成的组，或(2)所述AF1和所述AF2被构造成(Fab')2或单链双体。59.根据权利要求37
‑
58中任一项所述的多肽，其中所述AF2表现出小于或等于6.6的等电点(pI)。60.根据权利要求37
‑
59中任一项所述的多肽，其中所述AF2表现出在5.5和6.6之间、包括端点的pI。61.根据权利要求37
‑
60中任一项所述的多肽，其中所述AF2表现出在约5.5和6.6之间、或约5.6和约6.4之间、或约5.8和约6.2之间、或约6.0和约6.2之间的pI。62.根据权利要求37
‑
61中任一项所述的多肽，其中所述AF2表现出比由SEQ ID NO:781中所示的序列组成的参考抗原结合片段的pI低至少0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或1.0pH单位的pI。
63.根据权利要求37
‑
62中任一项所述的多肽，其中所述AF2表现出在所述AF1的pI的至少约0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4或约1.5pH单位内的pI。64.根据权利要求37
‑
63中任一项所述的多肽，其中所述AF2表现出在所述AF1的pI的至少约0.1至约1.5，或至少约0.3至约1.2，或至少约0.5至约1.0，或至少约0.7至约0.9pH单位内的pI。65.根据权利要求37
‑
64中任一项所述的多肽，所述多肽还包含第二释放区段(RS2)，其中所述RS2是用于被哺乳动物蛋白酶切割的底物。66.根据权利要求65所述的多肽，其中所述RS2是选自豆荚蛋白、MMP
‑
2、MMP
‑
7、MMP
‑
9、MMP
‑
11、MMP
‑
14、uPA和间质蛋白酶的底物。67.根据权利要求65或权利要求66所述的多肽，其中所述RS2包含与选自SEQ ID NO:53
‑
671的序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性的氨基酸序列。68.根据权利要求65
‑
67中任一项所述的多肽，其中所述RS1和所述RS2的序列是相同的。69.根据权利要求65
‑
67中任一项所述的多肽，其中所述RS1和所述RS2的序列是不同的。70.根据权利要求65
‑
69中任一项所述的多肽，其中所述RS1和所述RS2各自是用于被多于一种蛋白酶在每个释放区段序列内的一个、二个或三个切割位点处切割的底物。71.根据权利要求65
‑
70中任一项所述的多肽，所述多肽还包含第二延长重组多肽(XTEN2)，其中所述XTEN2的特征在于a.它具有至少约36个氨基酸；b.所述XTEN1序列的至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸残基选自甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、谷氨酸(E)和脯氨酸(P)；和c.它具有至少4
‑
6种不同的选自G、A、S、T、E和P的氨基酸。72.根据权利要求71所述的多肽，其中所述XTEN2包含含有SEQ ID NO:672
‑
675的氨基酸序列中的至少三个的氨基酸序列。73.根据权利要求71或权利要求72所述的多肽，其中所述XTEN2包含与选自SEQSEQ ID NO:676
‑
734的序列具有至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列。74.根据权利要求71
‑
73中任一项所述的多肽，其中所述XTEN2包含与选自以下序列的序列具有至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列：AE144_1A、AE144_2A、AE144_2B、AE144_3A、AE144_3B、AE144_4A、AE144_4B、AE144_5A、AE144_6B、AE144_7A、AE284、AE288_1、AE288_2、AE288_3、AE292、AE293、AE300、AE576、AE584、AE864、AE864_2、AE865、AE866、AE867和AE868，其中每个在表7中示出。75.根据权利要求71
‑
74中任一项所述的多肽，其中所述多肽具有如下从N
‑
端到C
‑
端的结构排列：XTEN1
‑
RS1
‑
AF1
‑
AF2
‑
RS2
‑
XTEN2、XTEN1
‑
RS1
‑
AF2
‑
AF1
‑
RS2
‑
XTEN2、XTEN2
‑
RS2
‑
AF2
‑
AF1
‑
RS1
‑
XTEN1、XTEN2
‑
RS2
‑
AF1
‑
AF2
‑
RS1
‑
XTEN1、XTEN2
‑
RS2
‑
双体
‑
RS1
‑
XTEN1或
XTEN1
‑
RS1
‑
双体
‑
RS2
‑
XTEN2，其中所述双体包含所述AF1和所述AF2的VL和VH，其中所述AF2特异性地结合CD3并且所述AF1特异性地结合EGFR，并且其中XTEN1和XTEN2具有相同或不同的氨基酸长度或序列。76.根据权利要求71
‑
75中任一项所述的多肽，其中所述AF1对所述EGFR的结合亲和力比所述AF2对CD3的结合亲和力大至少10倍、或大至少100倍、或大至少1000倍，如在体外抗原结合测定中所测量的。77.一种药物组合物，其包含根据前述权利要求中任一项所述的多肽和一种或更多种...

【专利技术属性】
技术研发人员：V，
申请(专利权)人：阿穆尼克斯制药公司，
类型：发明
国别省市：