释放区段及包含其的结合组合物制造技术

技术编号:26044400 阅读:44 留言:0更新日期:2020-10-23 21:23
本发明专利技术涉及包含切割释放区段的可活化重组多肽组合物。在一些情况下,所述可活化重组多肽组合物包含通过可切割的释放区段与结合部分连接的XTEN,当该释放区段切割时,该结合部分能够将效应T细胞与靶向的肿瘤细胞或癌细胞结合在一起,并实现该肿瘤细胞或癌细胞的细胞溶解。本发明专利技术还提供了制备和使用所述可切割的可活化重组组合物的组合物及方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】释放区段及包含其的结合组合物相关申请的交叉引用本申请要求2017年12月21日提交的系列号为62/609,296的美国临时申请和2018年12月17日提交的系列号为62/780,719的美国临时申请的优先权,所述临时申请通过引用整体并入本文。
技术介绍
癌症疗法的主要目标是特异性地破坏肿瘤细胞,同时尽可能地使健康细胞和组织不受损伤。最近受到关注的方法是诱导针对肿瘤的免疫应答,在肿瘤中,诱导免疫效应细胞如自然杀伤(NK)细胞或细胞毒性T淋巴细胞(CTL)攻击并破坏肿瘤细胞。尽管使用对肿瘤相关抗原具有亲和力的完整单克隆抗体(MAb)已成功地应用于癌症治疗领域,但完整MAb的大尺寸导致较差的生物分布,连同其在血池中的长持续时间一起,限制了其效用。另外,由于肿瘤坏死和不均匀的抗原分布,通常不可能以完整MAb到达肿瘤的中心部分。为了克服该问题,使用较小抗体片段可导致快速肿瘤定位和向肿瘤内的更深穿透,以及从血流中的快速移除。为此,衍生自MAb的单链片段(scFv)比完整MAb提供更好的生物分布,并且可更高效地靶向肿瘤细胞。尽管scFv有这些优点,但针对由病变组织本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种重组多肽,其包含第一释放区段(RS1),其中该RS1是被哺乳动物蛋白酶切割的底物。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20171221 US 62/609,296;20181217 US 62/780,7191.一种重组多肽,其包含第一释放区段(RS1),其中该RS1是被哺乳动物蛋白酶切割的底物。


2.根据权利要求1所述的重组多肽,其中所述RS1包含与选自表1所示序列的序列具有至少88%、或至少94%、或至少100%序列同一性的氨基酸序列。


3.根据权利要求1所述的重组多肽,其中所述RS1包含与选自表2所示序列的序列具有至少88%、或至少94%、或至少100%序列同一性的氨基酸序列。


4.根据权利要求1-3中任一项所述的重组多肽,其包含对靶组织或细胞上的靶细胞标志物具有结合亲和力的第一结合部分(FBM)。


5.根据权利要求4所述的重组多肽,其中所述哺乳动物蛋白酶由所述靶组织或细胞产生或与其共定位。


6.根据前述权利要求中任一项所述的重组多肽,其中所述RS1是丝氨酸蛋白酶和/或半胱氨酸蛋白酶和/或金属蛋白酶的底物。


7.根据前述权利要求中任一项所述的重组多肽,其中所述RS1是选自豆荚蛋白、MMP-2、MMP-7、MMP-9、MMP-11、MMP-14、uPA和matriptase的蛋白酶的底物。


8.根据前述权利要求中任一项所述的重组多肽,其中所述RS1是表3中所示的蛋白酶的底物。


9.根据前述权利要求中任一项所述的重组多肽,其中所述RS1是在一个、两个或三个切割位点被多种蛋白酶切割的底物。


10.根据前述权利要求中任一项所述的重组多肽,其中所述RS1是在两个或更多个切割位点被选自豆荚蛋白、MMP-2、MMP-7、MMP-9、MMP-11、MMP-14、uPA和matriptase的两种或更多种蛋白酶切割的底物。


11.根据前述权利要求中任一项所述的重组多肽,其中所述RS1是在三个或更多个切割位点被选自豆荚蛋白、MMP-2、MMP-7、MMP-9、MMP-11、MMP-14、uPA和matriptase的三种或更多种蛋白酶切割的底物。


12.根据前述权利要求中任一项所述的重组多肽,其中当在等效摩尔浓度下体外测定时,相比于具有序列EAGRSANHEPLGLVAT的对照序列被豆荚蛋白、MMP-2、MMP-7、MMP-9、MMP-11、MMP-14、uPA或matriptase切割的速率,所述RS1被相同蛋白酶切割的速率至少快两倍。


13.根据前述权利要求中任一项所述的重组多肽,其中当在等效摩尔浓度下体外测定时,相比于具有序列EAGRSANHEPLGLVAT的对照序列被豆荚蛋白、MMP-2、MMP-7、MMP-9、MMP-11、MMP-14、uPA或matriptase切割的速率,所述RS1被相同蛋白酶切割的速率至少慢两倍。


14.根据前述权利要求中任一项所述的重组多肽,其中所述RS1是被选自豆荚蛋白、MMP-2、MMP-7、MMP-9、MMP-11、MMP-14、uPA或matriptase的蛋白酶切割的底物,并且其中相比于具有序列EAGRSANHEPLGLVAT的对照序列被相同蛋白酶的切割,所述RS1在体外生物化学竞争性测定中的切割效率至少高0.2log2,或0.4log2,或0.8log2,或1.0log2。


15.根据前述权利要求中任一项所述的重组多肽,其中所述RS1是被选自豆荚蛋白、MMP-2、MMP-7、MMP-9、MMP-11、MMP-14、uPA或matriptase的蛋白酶切割的底物,并且其中相比于具有序列EAGRSANHEPLGLVAT的对照序列被相同蛋白酶的切割,所述RS1在体外生物化学竞争性测定中的切割效率至少低0.2log2,或0.4log2,或0.8log2,或1.0log2。


16.根据权利要求4-15中任一项所述的重组多肽,其中所述FBM为抗体、细胞因子、细胞受体或其片段。


17.根据前述权利要求中任一项所述的重组多肽,其进一步包含第一延伸重组多肽(XTEN1)。


18.根据权利要求17所述的重组多肽,其中所述XTEN1包含与选自表8或表10所示序列的序列具有至少约90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的氨基酸序列。


19.根据权利要求17或权利要求18所述的重组多肽,其中所述XTEN1包含与选自AE144_1A、AE144_2A、AEE144_2B、AE144_3A、AE144_3B、AE144_4A、AE144_4B、AE144_5A、AE144_6B、AE284、AE288_1、AE288_2、AE288_3、AE576、AE864、AE864_2、AE865、AE866、AE867和AE868的序列具有至少约90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的氨基酸序列。


20.根据权利要求17-19中任一项所述的重组多肽,其中所述重组多肽包含所述FBM、所述RS1和所述XTEN1,并且在未切割状态下具有FBM-RS1-XTEN1或XTEN1-RS1-FBM的N端至C端结构排列。


21.根据权利要求17-19中任一项所述的重组多肽,其中在所述RS1被所述哺乳动物蛋白酶切割后,所述XTEN1和FBM从所述重组多肽释放。


22.根据权利要求4-21中任一项所述的重组多肽,其中所述FBM为选自Fv、Fab、Fab'、Fab'-SH、线性抗体和单链可变片段(scFv)的抗体片段。


23.根据权利要求22所述的重组多肽,其中所述抗体片段对在选自浆细胞、T细胞、B细胞、细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK细胞)、肥大细胞、树突细胞、调节性T细胞(RegT细胞)、辅助T细胞、髓样细胞和NK细胞的效应细胞的表面上表达的效应细胞抗原具有结合亲和力。


24.根据权利要求23所述的重组多肽,其中所述效应细胞是T细胞。


25.根据权利要求23所述的重组多肽,其中所述效应细胞抗原是CD3。


26.根据权利要求23-25中任一项所述的重组多肽,其中所述抗体片段包含衍生自对CD3具有结合特异性的单克隆抗体的VL和VH。


27.根据权利要求26所述的重组多肽,其中所述VL和VH选自表4中所示的序列。


28.根据权利要求23-25中任一项所述的重组多肽,其中所述抗体片段包含衍生自对CD3具有结合特异性的单克隆抗体的互补决定区(CDR)。


29.根据权利要求28所述的重组多肽,其中所述抗体片段包含CDR-H1区、CDR-H2区、CDR-H3区、CDR-L1区、CDR-L2区和CDR-L3区,其中每一个衍生自表4的单克隆抗体。


30.根据权利要求4-29中任一项所述的重组多肽,其包含通过肽连接体与所述FBM融合的第二结合部分(SBM),其中所述SBM是对靶细胞标志物具有结合亲和力的抗体片段,其中所述抗体片段选自Fv、Fab、Fab'、Fab'-SH、线性抗体、单结构域抗体和单链可变片段(scFv),或者所述FBM和SBM的VL和VH被配置为单链双抗体。


31.根据权利要求30所述的重组多肽,其中所述靶细胞标志物是肿瘤细胞或癌细胞上的标志物。


32.根据权利要求30所述的重组多肽,其中所述靶细胞标志物选自表5中所示的靶细胞标志物。


33.根据权利要求30所述的重组多肽,其中所述靶细胞标志物选自A33抗原、甲胎蛋白(AFP)、α4整联蛋白、Ang2、B7-H3、B7-H6、B细胞成熟抗原(BCMA)、癌症抗原19-9(CA19-9)、癌症抗原125(CA-125)、碳酸酐酶6(CA6)、碳酸酐酶IX(CAIX)、CEACAM5、cMET、CTLA4、C-C基序趋化因子受体1(CCR1)、C-C基序趋化因子受体2(CCR2)、C-C基序趋化因子受体3(CCR3)、C-C基序趋化因子受体4(CCR4)、C-C基序趋化因子受体5(CCR5)、C-C基序趋化因子受体6(CCR6)、C-C基序趋化因子受体7(CCR7)、C-C基序趋化因子受体8(CCR8)、C-C基序趋化因子受体9(CCR9)、分化簇7(CD7)、CD22、CD70、CD79a、CD79b、CD19、CCR8、CEA、βhCG、Lewis-Y、CA19-9、CA-125、CD20、CD22、CD25、CD33、CD38、CD30、CD44v6、CD47、CD56(NCAM)、CD63、CD79b、CD123、CD133、CD138、CD166、密蛋白-1、密蛋白18.2、C型凝集素样分子-1(CLL-1)、C型凝集素域家族12(CLEC12)、Cora抗原、δ样典型Notch配体3(DDL3)、桥粒芯蛋白4、δ样非典型Notch配体1(DLK1)、外核苷酸焦磷酸酶/磷酸二酯酶3(ENPP3)、EGFR、EGFRvIII、EpCAM、内皮唾液酸蛋白(CD248)、表皮生长因子受体变体III(EGFRvIII)、EphA2、F19抗原、胎儿乙酰胆碱受体(fnAChR)、成纤维细胞活化抗原(FAP)、Fos相关抗原1(FRA1)、叶酸受体1(FOLR1)、岩藻糖基GM1、G250、神经节苷脂GD3、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(GPC3)、9-O-乙酰基-GD3、GM2、糖皮质激素诱导的TNF受体(GITR)、球六糖基神经酰胺(globo-H)、GD2、磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(GPC3)、鸟苷酸环化酶C(GCC)、HER2、HER2neu、HER3、HER4、HER1、IL13Rα2、胰岛素样生长因子I受体(IGF-IR)、溶酶体相关膜蛋白1(LAMP1)、L1细胞黏附分子(L1CAM)、淋巴细胞抗原6(Ly-6)、黑素瘤硫酸软骨素蛋白聚糖(MCSP)、膜型金属蛋白酶(MT-MMP)、间皮素、黏蛋白1(MUC1)、MUC2、MUC3、MUC4、MUC5AC、MUC5B、MUC7、MUC16、II型穆勒管抑制物质受体(MISIIR)、柄蛋白细胞黏附分子4(柄蛋白-4)、前列腺6-跨膜上皮抗原(STEAP)、浆细胞抗原1、前列腺干细胞抗原(PSCA)、程序性细胞死亡1(PD1)、程序性死亡配体1(PD-L1)、PSMA、受体酪氨酸激酶样孤儿受体1(ROR1)、唾液酸化Tn抗原(sTN)、钠依赖性磷酸转运蛋白2b(NaPi2b)、音猬因子(Shh)、SAS、SLAM家族成员7(SLAM7)、促生长素抑制素受体2(SSTR2)、精子自身抗原蛋白17(SP17)、TAG72、Thomsen-Friedenreich抗原(TF抗原)、肿瘤相关抗原L6(TAL6)、滋养层糖蛋白(5T4)、Trop-2、Wue-1、VEGFR1、VEGFR2和维尔姆斯瘤蛋白(WT1)。


34.根据权利要求30-33中任一项所述的重组多肽,其中所述SBM是包含VL和VH的抗体片段,所述VL和VH衍生自对所述靶细胞标志物具有结合亲和力的单克隆抗体。


35.根据权利要求34所述的重组多肽,其中所述VL和VH选自表5中所示的序列。


36.根据权利要求30-33中任一项所述的重组多肽,其中所述抗体片段包含CDR-H1区、CDR-H2区、CDR-H3区、CDR-L1区、CDR-L2区和CDR-L3区,其中每一个衍生自表5中所示的单克隆抗体。


37.根据权利要求30-36中任一项所述的重组多肽,其中所述重组多肽包含所述FBM、所述SBM、所述RS1和所述XTEN1,并且在未切割状态下具有SBM-FBM-RS1-XTEN1、FBM-SBM-RS1-XTEN1、XTEN1-RS1-SBM-FBM、XTEN1-RS1-FBM-SBM或双抗体-RS1-XTEN1或XTEN1-RS1-双抗体的N端至C端结构排列,其中所述双抗体包含所述FBM和SBM的VL和VH。


38.根据权利要求30-36中任一项所述的重组多肽,其中所述重组多肽包含与选自表14所示序列的序列具有至少约90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的氨基酸序列。


39.根据权利要求30-38中任一项所述的重组多肽,其中在所述RS1被所述哺乳动物蛋白酶切割并且从所述重组多肽释放所述FBM和SBM后,所述FBM和SBM保持融合,并且在包含携带CD3抗原的T细胞和携带靶细胞标志物的肿瘤细胞两者的体外测定中能够与该T细胞和该肿瘤细胞结合并将其连接在一起。


40.根据权利要求39所述的重组多肽,其中所释放的FBM和SBM与所述T细胞和所述肿瘤细胞结合在一起在所述体外测定中导致针对该肿瘤细胞的细胞毒活性,如通过细胞溶解或细胞内组分的释放的定量所确定的。


41.根据权利要求40所述的重组多肽,其中相比于在等效摩尔浓度下进行的体外测定中由未切割的重组多肽实现的细胞溶解,所述重组多肽的释放的FBM和SBM能够实现更大量的肿瘤细胞的细胞溶解,如通过细胞溶解或细胞内组分的释放的定量所确定的。


42.根据权利要求40或权利要求41所述的重组多肽,其中相比于在等效摩尔浓度下进行的体外测定中由未切割的重组多肽实现的细胞溶解,由所述重组多肽的释放的FBM和SBM实现的细胞溶解的量高至少10倍,或高至少30倍,或至少100倍,或至少300倍,或至少1000倍,或至少10,000倍,如通过细胞溶解或细胞内组分的释放的定量所确定的。


43.根据权利要求40-42中任一项所述的重组多肽,其中所述细胞毒活性和/或肿瘤细胞的细胞溶解由所述T细胞的靶标特异性活化介导。


44.根据权利要求43所述的重组多肽,其中相比于由未切割的重组多肽实现的活化,由所释放的FBM和SBM实现的T细胞活化的量高至少10倍,或高至少30倍,或至少100倍,或至少300倍,或至少1000倍,或至少10,000倍,如通过在等效摩尔浓度下进行的体外测定中T细胞衍生的效应分子的定量所确定的。


45.根据权利要求30-38中任一项所述的重组多肽,其中在所述RS1被所述哺乳动物蛋白酶切割并且从所述重组多肽释放所述FBM和SBM后,所述FBM和SBM保持融合,并且当在等效摩尔浓度下测定时,其在包含CD3抗原或靶细胞标志物的体外测定中表现出的对该CD3抗原和/或该靶细胞标志物的结合亲和力高于未切割的重组多肽对该CD3抗原或对该靶细胞标志物的结合亲和力。


46.根据权利要求30-38中任一项所述的重组多肽,其中当在等效摩尔浓度下测定时,相比于未切割的重组多肽对所述CD3抗原或对所述靶细胞标志物的结合亲和力,所释放的FBM对所述CD3抗原或所释放的SBM对所述靶细胞标志物的结合亲和力高至少3倍,或高至少10倍,或至少30倍,或至少100倍,或至少300倍,或至少1000倍,如在体外测定中以解离常数(Kd)形式所测定的。


47.根据权利要求46所述的重组多肽,其中所述重组多肽的释放的FBM与所述CD3抗原结合的Kd常数在10-5至10-9M之间,并且所释放的SBM与所述靶标特异性标志物结合的Kd在10-5至10-9M之间。


48.根据权利要求46所述的重组多肽,其中当在等效摩尔浓度下测定时,相比于所释放的FBM对所述CD3抗原的较低结合亲和力,所释放的SBM对所述靶细胞标志物的结合亲和力高至少一个数量级,如在体外测定中以Kd常数形式所测定的。


49.根据权利要求39-48中任一项所述的重组多肽,其中所述体外测定选自细胞膜完整性测定、混合细胞培养测定、基于FACS的碘化丙锭测定、台盼蓝流入测定、光度测量酶释放测定、辐射测量51Cr释放测定、荧光测量铕释放测定、CalceinAM释放测定、光度测量MTT测定、XTT测定、WST-1测定、阿拉玛蓝测定、辐射测量3H-Thd掺入测定、测定细胞分裂活性的克隆形成测定、测量线粒体跨膜梯度的荧光测量罗丹明123测定、通过基于FACS的磷脂酰丝氨酸暴露监测的凋亡测定、基于ELISA的TUNEL测试分析、夹心ELISA、胱天蛋白酶活性测定、基于细胞的LDH释放测定和细胞形态学测定,或上述的任意组合。


50.根据权利要求17-49中任一项所述的重组多肽,其进一步包含i)第二释放区段(RS2),其为被哺乳动物蛋白酶切割的底物,以及ii)第二XTEN(XTEN2),其中在未切割状态下,所述重组多肽具有如下的N端至C端结构排列:XTEN1-RS1-SBM-FBM-RS2-XTEN2、XTEN1-RS1-FBM-SBM-RS2-XTEN2、XTEN2-RS2-SBM-FBM-RS1-XTEN1、XTEN2-RS2-FBM-SBM-RS1-XTEN1、XTEN2-RS2-双抗体-RS1-XTEN1,其中所述双抗体包含所述FBM和SBM的VL和VH,或XTEN1-RS1-双抗体-RS2-XTEN2,其中所述双抗体包含所述FBM和SBM的VL和VH。


51.根据权利要求50所述的重组多肽,其中所述XTEN2包含与选自表8或表10所示序列的序列具有至少约90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的氨基酸序列。


52.根据权利要求50所述的重组多肽,其中所述XTEN2包含与选自AE144_1A、AE144_2A、AEE144_2B、AE144_3A、AE144_3B、AE144_4A、AE144_4B、AE144_5A、AE144_6B、AE284、AE288_1、AE288_2、AE288_3、AE576、AE864、AE864_2、AE865、AE866、AE867和AE868的序列具有至少约90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的氨基酸序列。


53.根据权利要求50-52中任一项所述的重组多肽,其中所述RS2序列与所述RS1序列相同。


54.根据权利要求50-52中任一项所述的重组多肽,其中
所述RS2序列与所述RS1序列不同;并且包含与选自表1或表2序列的序列具有至少88%或至少94%序列同一性的氨基酸序列。


55.根据权利要求50-52中任一项所述的重组多肽,其中所述RS2序列与所述RS1序列不同,并且包含选自表1或表2序列的序列。


56.根据权利要求50-55中任一项所述的重组多肽,其中所述重组多肽包含与选自表15或表18所示序列的序列具有至少约90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的氨基酸序列。


57.一种包含RS1、RS2、FBM、SBM、XTEN1和XTEN2的重组多肽,其中:
a.所述RS1和RS2,其中所述RS1和RS2各自为被哺乳动物蛋白酶切割的底物,并且各自包含与选自表2序列的序列具有至少90%、至少93%、至少97%或100%序列同一性的氨基酸序列;
b.所述FBM是包含VL和VH的抗体片段,该VL和VH衍生自对效应细胞具有结合特异性的单克隆抗体;
c.所述SBM是包含VL和VH的抗体片段,该VL和VH衍生自对靶细胞标志物具有结合亲和力的单克隆抗体
d.所述XTEN1和XTEN2各自包含与选自表10所示序列的序列具有至少约90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的氨基酸序列;并且
e.所述重组多肽具有如下的N端至C端结构排列:XTEN1-RS1-SBM-FBM-RS2-XTEN2、XTEN1-RS1-FBM-SBM-RS2-XTEN2、XTEN2-RS2-SBM-FBM-RS1-XTEN1、XTEN2-RS2-FBM-SBM-RS1-XTEN1、XTEN2-RS2-双抗体-RS1-XTEN1,其中所述双抗体包含所述FBM和SBM的VL和VH。


58.根据权利要求56所述的重组多肽,其中所述效应细胞是T细胞,并且所述靶细胞标志物选自A33抗原、甲胎蛋白(AFP)、α4整联蛋白、Ang2、B7-H3、B7-H6、B细胞成熟抗原(BCMA)、癌症抗原19-9(CA19-9)、癌症抗原125(CA-125)、碳酸酐酶6(CA6)、碳酸酐酶IX(CAIX)、CEACAM5、cMET、CTLA4、C-C基序趋化因子受体1(CCR1)、C-C基序趋化因子受体2(CCR2)、C-C基序趋化因子受体3(CCR3)、C-C基序趋化因子受体4(CCR4)、C-C基序趋化因子受体5(CCR5)、C-C基序趋化因子受体6(CCR6)、C-C基序趋化因子受体7(CCR7)、C-C基序趋化因子受体8(CCR8)、C-C基序趋化因子受体9(CCR9)、分化簇7(CD7)、CD22、CD70、CD79a、CD79b、CD19、CCR8、CEA、βhCG、Lewis-Y、CA19-9、CA-125、CD20、CD22、CD25、CD33、CD38、CD30、CD44v6、CD47、CD56(NCAM)、CD63、CD79b、CD123、CD133、CD138、CD166、密蛋白-1、密蛋白18.2、C型凝集素样分子-1(CLL-1)、C型凝集素域家族12(CLEC12)、Cora抗原、δ样典型Notch配体3(DDL3)、桥粒芯蛋白4、δ样非典型Notch配体1(DLK1)、外核苷酸焦磷酸酶/磷酸二酯酶3(ENPP3)、...

【专利技术属性】
技术研发人员:杨帆V·谢尔恩伯杰弗拉迪米尔·波杜斯特沈美贞德西蕾·赛耶约翰·比伯
申请(专利权)人:阿穆尼克斯制药公司
类型:发明
国别省市:美国;US

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