抗PD-1/抗HER2天然抗体结构的异源二聚双特异性抗体及其制备方法技术

本发明专利技术提供了一种抗PD‑1/抗HER2天然抗体结构的异源二聚双特异性抗体及其制备方法。更具体地，本发明专利技术提供了一种具有天然IgG特征而在重链和轻链之间没有错配的高度稳定的异源二聚抗PD‑1/抗HER2双特异性抗体及其制备方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】抗PD-1/抗HER2天然抗体结构的异源二聚双特异性抗体及其制备方法
本专利技术涉及抗PD-1/抗HER2天然抗体结构的异源二聚双特异性抗体及其制备方法，更具体地，涉及一种具有天然IgG特征而在重链和轻链之间没有错配的高度稳定的异源二聚抗PD-1/抗HER2双特异性抗体及其制备方法。
技术介绍
单克隆抗体是仅作用于单一抗原表位的高度特异性抗体，已被广泛用于许多疾病的治疗，例如癌症、炎性疾症、自身免疫性疾病和感染性疾病。但是，这种治疗分子在单独使用时，该治疗分子不能显示出足够的药效。这可能是由于疾病的复杂性。例如，癌症或炎性疾病通常涉及多种疾病介导的分子通路以及信号通路之间的相叉作用。在这些情况下，靶向单一靶标的分子不能提供最佳的治疗效果。通过同时阻断多个靶标或者阻断同一靶标的多个位点处的分子能够改善治疗效果。由于多特异性分子、例如双特异性分子是单一分子，多特异性分子可以使得进行双靶向治疗可以简化新药的开发过程。与使用多个单特异性分子组合相比，使用多特异性分子对于患者和医疗服务提供者都更方便。许多不同形式的双特异抗体或双功能分子已在该领域被报道。最初的双特异抗体是通过应用化学方法使用双功能偶联试剂将IgG分子、Fab’或(Fab’)2片段连接而制备的。但是，这种化学偶联的双特异性抗体具有很多的局限性，例如生产的劳动强度、异源偶联物和同源偶联物的纯化、以及去除初始单特异性抗体或其片段的复杂性；以及低收率。用于产生双特异性抗体的另一种方法是使用杂交-杂交瘤(或四源杂交瘤)技术，其是采用体细胞融合两种分泌不同抗体的杂交瘤细胞系。由于免疫球蛋白重链和轻链的随机配对，仅有抗体的1/10是所需的功能性双特异性抗体，这因而可能使纯化过程复杂化并降低产率。WO2013/060867公开了一种大规模生产异源二聚双特异性抗体的方法。在该方法中，首先还原两种混合的同源二聚抗体。然后，在这两种同源二聚抗体的CH3区中引入不对称氨基酸突变，从而促使不同抗体的Fab臂交换。最后，通过氧化铰链区的链间二硫键来形成稳定的双特异性抗体。WO2009/089004公开了一种用于制备异源二聚蛋白质的方法。在该方法中，在CH3-CH3界面处的氨基酸突变为带电荷氨基酸，从而通过静电作用促进异源二聚体的形成。然而，该方法不利于同源二聚体的形成。US5,731,168公开了一种利用“突起-腔”策略来制备异源二聚IgG的方法。在该方法中，通过用较大的氨基酸侧链替换来自第一多肽的CH3结构域的界面的小氨基酸侧链来构建“突起”，并且在该多肽的CH3结构域的界面中产生补偿性“腔”。突起和腔之间的相互作用有利于异源二聚IgG的形成，并且在同源二聚体的形成中无效。WO2012/058768描述了一种制备高度特异性稳定的异源二聚IgG的方法。该方法组合了阴性和阳性设计以及结构和计算机模型指导的蛋白工程技术，并且允许待设计的IgG1CH3结构域中的多个突变的新型组合，从而形成同源二聚体杂质含量低的稳定异源二聚IgG。程序性死亡受体-1(PD-1)近期作为免疫检查点受到关注，其参与T细胞活化的调控，并且调节免疫应答的强度和持续时间。在正常情况下，PD-1可以介导和维持机体组织的自身免疫耐受，并防止在炎性反应过程中免疫系统的过度活化及其自身组织的伤害，因此提供了积极作用。然而，在病理情况下，PD-1参与各种肿瘤和自身免疫疫病的发生和发展(AnticancerAgentsMedChem.2015；15(3):307-13.HematolOncolStemCellTher.2014年3月；7(1):1-17.TrendsMolMed.2015年1月；21(1):24-33.Immunity.2013年7月25日；39(1):61-73.JClinOncol.2015年6月10日；33(17):1974-82.)。PD-1属于CD28家族，但不同于CD28家族的其它成员、例如CTLA4，CTLA4能以二硫键形成共价二聚体，而PD-1以单体形式存在。PD-1的结构主要包括胞外免疫球蛋白可变区样结构域、疏水的跨膜结构域和胞内结构域，并且胞内结构域含有两个独立的磷酸化位点，分别为免疫受体酪氨酸基抑制基序(ITIM)和免疫受体酪氨酸基转移基序(ITSM)。PD-1主要诱导为在活化的T细胞表面上表达，并且也在B细胞、NK细胞、单核细胞和DC细胞中表达。PD-1的配体包括程序性死亡配体1(PD-L1)和程序性死亡配体2(PD-L2)，并且该配体属于B7家族，其中PD-L1诱导为在包括T细胞、B细胞、单核细胞、巨噬细胞、DC细胞、内皮细胞和表皮细胞等的多种免疫细胞的表面上表达，而PD-L2仅诱导为在包括巨噬细胞、DC细胞和B细胞等的一些免疫细胞中表达(AutoimmunRev,2013,12(11):1091-1100.FrontImmunol,2013,4:481.NatRevCancer,2012,12(4):252-264.TrendsMolMed.2015Jan；21(1):24-33.)。在二十世纪80年代，DenisSlamon首次在189个原发性乳腺癌病例的30％中发现HER2(人表皮生长因子受体2)基因过度扩增，并发现HER2与总存活率和复发时间密切相关(SalmanDJ等人,Science,235:177-182,1985)。目前的研究表明，大约25百分比(％)至30％的乳腺癌患者中的HER2过表达(RevillionF等人,EurJCancer,34:791-808,1998)，且这些研究与肿瘤的恶性生长程度相关(WrightC等人,CancerRes,49:2087-2090,1989)。曲妥珠单抗是一种人源化单克隆抗体的抗HER2胞外结构域(CarterP等人，PNAS,89(10):4285-4289,1992)。然而，曲妥珠单抗在临床应用中的抗癌效果往往没有临床前实验那么好。因此，曲妥珠单抗通常需要与化疗药等组合使用(SlamonDJ等人，NEnglJMed,344:783-792,2001)。设计一种可以募集效应细胞的双功能抗体在提高抗体效能中是有效的。目前为止，最多数量的研究是利用CD3分子的功能。CD3分子通过激活杀伤性T细胞而可以有效地清除目标肿瘤(HaasC等人，Immunobiology,214:441-453,2009)。Micormet开发的重组双特异性T细胞衔接子(BiTE)具有良好的前景；但是，最大的问题在于血浆半衰期非常短，在人体中半衰期仅为1小时(LofflerA等人，Blood,95:2098-2103)。这是由BiTE本身的结构所导致的，其由两个单链抗体片段组成，分子量仅为60千道尔顿(kDa)，并且缺失了抗体分子中对延长半衰期有重要作用的Fc片段。卡妥索单抗是另一种具有前景的多功能抗体，是一种靶向CD3和EpCAM的杂合Ig分子。卡妥索单抗已被批准用于腹水癌的治疗(JagerM,等人，CancerRes,72:24-32,2012)。另一种处于临床二期的多功能抗体为厄妥索单抗本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种异源二聚双特异性抗体，其包含：能够与PD-1特异性结合的第一个抗原结合位点和能够与HER2特异性结合的第二个抗原结合位点，其中所述双特异性抗体包含通过至少一个二硫键彼此链接的第一Fc链和第二Fc链，其中所述第一Fc链和所述第二Fc链各自通过共价键或连接基团分别连接到PD-1抗原结合位点和HER2抗原结合位点，或者所述第一Fc链和所述第二Fc链各自通过共价键或连接基团分别连接到HER2抗原结合位点和PD-1抗原结合位点，并且所述PD-1抗原结合位点中的免疫球蛋白轻链可变区的氨基酸序列为SEQ IDNO.10，所述PD-1抗原结合位点中的免疫球蛋白重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO.12，并且所述第一Fc链和所述第二Fc链在如下位置处包含5个氨基酸的替换：/n所述第一Fc链包含366位氨基酸和399位氨基酸的氨基酸替换，并且所述第二Fc链包含351位氨基酸、407位氨基酸和409位氨基酸的氨基酸替换，/n其中各自包含所述氨基酸替换的所述第一Fc链和所述第二Fc链各自倾向于一起形成异源二聚体而不倾向于形成同源二聚体，/n其中氨基酸位置根据Kabat EU索引编号系统编号。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20180208 CN PCT/CN2018/0758511.一种异源二聚双特异性抗体，其包含：能够与PD-1特异性结合的第一个抗原结合位点和能够与HER2特异性结合的第二个抗原结合位点，其中所述双特异性抗体包含通过至少一个二硫键彼此链接的第一Fc链和第二Fc链，其中所述第一Fc链和所述第二Fc链各自通过共价键或连接基团分别连接到PD-1抗原结合位点和HER2抗原结合位点，或者所述第一Fc链和所述第二Fc链各自通过共价键或连接基团分别连接到HER2抗原结合位点和PD-1抗原结合位点，并且所述PD-1抗原结合位点中的免疫球蛋白轻链可变区的氨基酸序列为SEQIDNO.10，所述PD-1抗原结合位点中的免疫球蛋白重链可变区的氨基酸序列为SEQIDNO.12，并且所述第一Fc链和所述第二Fc链在如下位置处包含5个氨基酸的替换：
所述第一Fc链包含366位氨基酸和399位氨基酸的氨基酸替换，并且所述第二Fc链包含351位氨基酸、407位氨基酸和409位氨基酸的氨基酸替换，
其中各自包含所述氨基酸替换的所述第一Fc链和所述第二Fc链各自倾向于一起形成异源二聚体而不倾向于形成同源二聚体，
其中氨基酸位置根据KabatEU索引编号系统编号。


2.根据权利要求1所述的异源二聚双特异性抗体，其中，所述第一Fc链和所述第二Fc链的所述氨基酸替换如下：
a)L351G、L351Y、L351V、L351P、L351D、L351E、L351K或L351W；
b)T366L、T366P、T366W或T366V；
c)D399C、D399N、D399I、D399G、D399R、D399T或D399A；
d)Y407L、Y407A、Y407P、Y407F、Y407T或Y407H；和
e)K409C、K409P、K409S、K409F、K409V、K409Q或K409R。


3.根据权利要求1或2所述的异源二聚双特异性抗体，其中，所述氨基酸替换包括：
a)所述第一Fc链的T366L和D399R替换，以及所述第二Fc链的L351E、Y407L和K409V替换；
b)所述第一Fc链的T366L和D399C替换，以及所述第二Fc链的L351G、Y407L和K409C替换；
c)所述第一Fc链的T366L和D399C替换，以及所述第二Fc链的L351Y、Y407A和K409P替换；
d)所述第一Fc链的T366P和D399N替换，以及所述第二Fc链的L351V、Y407P和K409S替换；
e)所述第一Fc链的T366W及D399G替换，以及所述第二Fc链的L351D、Y407P和K409S替换；
f)所述第一Fc链的T366P和D399I替换，以及所述第二Fc链的L351P、Y407F和K409F替换；
g)所述第一Fc链的T366V和D399T替换，以及所述第二Fc链的L351K、Y407T和K409Q替换；以及
h)所述第一Fc链的T366L和D399A替换，以及所述第二Fc链的L351W、Y407H和K409R替换。


4.根据权利要求1所述的异源二聚双特异性抗体，其中，所述第一Fc链的氨基酸替换为T366L和D399R，并且所述第二Fc链的氨基酸替换为L351E、Y407L和K409V。


5.根据权利要求1-4中任一项所述的异源二聚双特异性抗体，其中，所述Fc链来源于免疫球蛋白G(IgG)。


6.根据权利要求1-5中任一项所述的异源二聚双特异性抗体，其中，所述PD-1抗原结合位点和HER2抗原结合位点为Fab片段或scFv片段。


7.根据权利要求1-5中任一项所述的异源二聚双特异性抗体，其中，所述PD-1抗原结合位点和HER2抗原结合位点各自为Fab片段。


8.根据权利要求1-5中任一项所述的异源二聚双特异性抗体，其中，选自所述PD-1抗原结合位点和HER2抗原结合位点中的一个为Fab片段，而另一个为scFv片段。


9.根据权利要求6-8中任一项所述的异源二聚双特异性抗体，其中，所述Fab片段包含不同的第一重链可变区和第二重链可变区，以及不同的第一轻链可变区和第二轻链可变区。


10.根据权利要求1-9中任一项所述的异源二聚双特异性抗体，其中，当所述第一Fc链和连接到所述第一Fc链的所述PD-1抗原结合位点、以及所述第二Fc链和连接到所述第二Fc链的所述HER2抗原结合位点；或者所述第一Fc链和连接到所述第一Fc链的所述HER2抗原结合位点、以及所述第二Fc链和连接到所述第二Fc链...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘家望，宋楠萌，杨亚平，金孟燮，闫尧，尹晴晴，
申请(专利权)人：北京韩美药品有限公司，信达生物制药苏州有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11