一种抗癌胚抗原的高亲和力纳米抗体及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种抗癌胚抗原CEA的高亲和力纳米抗体，所述纳米抗体具有独特的3个互补决定区CDR1、CDR2、CDR3，本发明专利技术还公开了所述纳米抗体在制备肿瘤治疗药物中的应用。本发明专利技术提供的抗CEA的纳米抗体对CEA抗原具有特异的识别和结合能力，并且对于肿瘤细胞MKN‑45具有显著的ADCC效应，而且可以在小鼠体内实现肿瘤的精确成像。

【技术实现步骤摘要】
一种抗癌胚抗原的高亲和力纳米抗体及其应用
本专利技术公开了一种纳米抗体，属于免疫学领域。
技术介绍
癌胚抗原(CEA，又称为CEACAM-5或CD66e)是一种具有约180kDa分子量的糖蛋白。CEA是免疫球蛋白超家族的一名成员，并且含有经由糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚与细胞膜连接的7个域。7个域包括单一N端Ig可变域和与Ig恒定域同源的6个域(A1-B1-A2-B2-A3-B3)。CEA最初分类为仅在胎儿组织中表达的蛋白质，现在已经在几种正常成年组织中鉴定出。CEA的过量表达在许多类型的癌症中观察到，包括结肠直肠癌、胰腺癌、肺癌、胃癌、肝细胞瘤、乳腺癌和甲状腺癌。因此，CEA已经被鉴定为肿瘤相关抗原。CEA容易自细胞表面切割，并直接或经由淋巴系统自肿瘤脱落入血流中。由于此特性，已经使用血清CEA的水平作为临床标志物以诊断癌症并筛选癌症。而且，CEA也已被用作肿瘤标记，测量癌症患者血液中升高的CEA的免疫学测定法已在临床上用于癌症的预后和控制。更重要的是，CEA已成为用于靶向治疗的潜在有用的肿瘤相关抗原。已经报道的使用CEA靶向免疫治疗癌症主要有2种主要方法。一种方法使用抗CEA抗体引发免疫细胞的溶解活性，特别是通过抗体依赖性细胞毒性(ADCC)或补体依赖性细胞毒性(CDC)，以消除表达CEA的肿瘤细胞。另一种方法是通过抗CEA抗体或抗体片段与例如药物、毒素、放射性核苷酸、免疫调节剂或细胞因子等效应分子缀合，特异性靶向表达CEA的肿瘤细胞，从而发挥效应分子的治疗作用。目前已经针对CEA生成多种单克隆抗体。Chester等已经自噬菌体展示文库分离出单链抗CEA抗体以在放射性免疫检测和放射性免疫疗法中使用(美国专利No.5,876,691)，随后将抗体人源化(美国专利No.7,232,888)。放射性标记的抗CEA抗体已经在结肠直肠癌患者的临床试验中使用。在骆驼科动物(骆驼，单峰骆驼和美洲驼)的体内存在着一类仅有重链二聚体抗体H2，其主要是IgG2和IgG3类型。此类抗体由于缺乏轻链，于是将这种抗体称为仅有重链的抗体(heavychain-only-likeAntibody，HCAbs)，而它们的抗原结合部位由一个结构域组成，称为VHH区，因此该类抗体也被称为单结构域抗体或者单域抗体(sdAb)。由于该类抗体为去除恒定区后的可变区序列，分子量只有15kD，大约10纳米的直径，因此也被称为纳米抗体(Nbs)。另外，在鲨鱼中也观察到这类单结构域抗体，称为VNAR。这种仅有重链的抗体原来只是作为一种人类B细胞增生性疾病(重链病)的病理形式被人们所认识，这种仅有重链的抗体可能是由于基因组水平的突变和缺失而导致重链CH1结构域不能表达，使得表达出的重链缺乏CH1，从而缺乏与轻链的结合能力，从而形成一种重链二聚体。相对于常规的四链抗体的scFv而言，纳米抗体在亲和力方面与其对应的scFv相当，但在可溶性、稳定性、对聚集的抗性、可重折叠性、表达产率以及DNA操作、文库构建和3-D结构测定的容易性方面超越scFv。纳米抗体有来源于成年骆驼体内HCAbs的最小的功能性抗原结合片段，具有高度稳定性和与抗原结合的高亲合力，能与蛋白裂隙和酶活性位点的相互作用，使之作用类似于抑制剂。因此，纳米抗体可以为从肽模拟药物设计小分子酶抑制物提供新的思路。由于仅有重链，纳米抗体的制造较mAb容易。纳米抗体的独特性质，如处于极端温度和pH环境中的稳定性，可以低成本制造大产量。因此，纳米抗体在疾病的治疗和诊断中具有很大的价值，在肿瘤的抗体靶向诊断和治疗中也具有很大的发展前景。鉴于CEA更多地过量表达于一些诸如结肠直肠癌、胰腺癌、肺癌、胃癌、肝细胞瘤、乳腺癌和甲状腺癌等实体肿瘤中，因此研发抗CEA的纳米抗体，充分发挥纳米抗体超强的抗原识别能力，特别是识别一些隐匿于裂隙或空腔里的抗原决定簇成为抗体
的一种新的需求。但是鉴于纳米抗体分子过低而存在的一些诸如亲和力低、易于集聚、血清半衰期短等结构缺陷却阻碍着纳米抗体的进一步应用。本专利技术的目的就是提供一种能够充分发挥纳米抗体的优越性能，又能克服其固有缺陷的抗CEA的纳米抗体，并进一步发挥其在人体样本的CEA检测和在制药学领域中的应用。
技术实现思路
基于上述专利技术目的，本专利技术首先提供了一种抗癌胚抗原的纳米抗体，所述纳米抗体的可变区具有3个互补决定区CDR1、CDR2、CDR3，其中，CDR1序列由SEQIDNO.13所述氨基酸序列组成，并且CDR2序列由SEQIDNO.14所述氨基酸序列组成，并且CDR3序列由SEQIDNO.15所述氨基酸序列组成。在一个优选的技术方案中，所述纳米抗体的可变区序列由SEQIDNO.16所述氨基酸序列组成。第二，本专利技术还提供了一种含有上述纳米抗体的可变区的抗体，所述抗体还具有恒定区，所述抗体的恒定区序列由SEQIDNO.17所述氨基酸序列组成。第三，本专利技术还提供了一种编码上述抗体的序列的多核苷酸分子，所述多核苷酸分子的序列由SEQIDNO.18所示。第四，本专利技术提供了一种含有上述多核苷酸分子的表达载体。在一个优选的技术方案中，所述载体为pMES4。第五，本专利技术提供了一种含有上述表达载体的宿主细胞。在一个优选的技术方案中，所述细胞为大肠杆菌BL21(DE3)。最后，本专利技术还提供了上述的纳米抗体在制备肿瘤治疗药物中的应用。本专利技术提供的抗CEA的纳米抗体，由于具有独特的CDR1、2、3区序列，使所述抗体对CEA抗原具有特异的识别和结合能力，而与其它非特异性交叉反应性蛋白没有反应。本专利技术提供的纳米抗体具有显著的ADCC效应，能够诱导表达CEA的肿瘤细胞MKN-45的裂解，而对于不表达CEA的MKN-74细胞则不具有这种效应，显示了在肿瘤治疗药物制备中的应用前景。而且，本专利技术提供的抗CEA纳米抗体可以在小鼠体内实现肿瘤的精确成像，显示了在诊断试剂制备和体内成像技术中的应用前景。附图说明图1.pMES4表达载体结构示意图；图2.提取的总RNA电泳鉴定图；图3.第一轮PCR扩增抗体可变区基因电泳鉴定图；图4.第二轮PCR扩增抗体可变区基因电泳鉴定图；图5.pMES4载体双酶切反应产物电泳鉴定图；图6.菌落PCR鉴定转化子电泳鉴定图；图7.纳米抗体SDS-PAGE鉴定图；图8.融合表达载体构建示意图；图9.纳米抗体与融合表达载体双酶切电泳鉴定图；图10.纳米抗体纯化SDS-PAGE图；图11.纳米抗体ADCC效应曲线；图12.标记纳米抗体对小鼠移植肿瘤的成像定位结果图具体实施方式下面结合具体实施例来进一步描述本专利技术，本专利技术的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本专利技术的保护范围构成任何限制。实施例1抗CEA纳米抗体噬菌体展示文库库的构建及筛选1.1羊驼的免疫：选取健康成年羊驼一只羊，将重组蛋白CEA与弗氏佐剂按1:1本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种抗癌胚抗原的纳米抗体，所述纳米抗体的可变区具有3个互补决定区CDR1、CDR2、CDR3，其中，CDR1序列由SEQ ID NO.13所述氨基酸序列组成，并且CDR2序列由SEQ IDNO.14所述氨基酸序列组成，并且CDR3序列由SEQ ID NO.15所述氨基酸序列组成。/n

【技术特征摘要】
1.一种抗癌胚抗原的纳米抗体，所述纳米抗体的可变区具有3个互补决定区CDR1、CDR2、CDR3，其中，CDR1序列由SEQIDNO.13所述氨基酸序列组成，并且CDR2序列由SEQIDNO.14所述氨基酸序列组成，并且CDR3序列由SEQIDNO.15所述氨基酸序列组成。


2.根据权利要求1所述的纳米抗体，其特征在于，所述纳米抗体的可变区序列由SEQIDNO.16所述氨基酸序列组成。


3.一种含有权利要求2所述纳米抗体的可变区的抗体，其特征在于，所述抗体还具有恒定区，所述抗体的恒定区序列由SEQIDNO.17所...

【专利技术属性】
技术研发人员：宋海鹏，于建立，古一，李飞，王欢，刘原源，周宇航，黄琪，李婧婵，
申请(专利权)人：深圳市国创纳米抗体技术有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44