鲨鱼单个核细胞的分离方法、鲨鱼稀释液及其用途技术

本发明专利技术属于细胞分离技术领域，具体涉及一种鲨鱼单个核细胞的分离方法、鲨鱼稀释液及其用途。一种鲨鱼稀释液，该鲨鱼稀释液包括PBS缓冲液及尿素，其密度为1.0028 g/mL

【技术实现步骤摘要】
鲨鱼单个核细胞的分离方法、鲨鱼稀释液及其用途


[0001]本专利技术属于细胞分离
，具体涉及一种鲨鱼单个核细胞的分离方法、鲨鱼稀释液及其用途。

技术介绍

[0002]外周血单个核细胞(Peripheral blood mononuclear cell，PBMC)是指外周血中仅具单个核的细胞，包含淋巴细胞和单核细胞两大类。条纹斑竹鲨是一种广泛分布于中国东南部海域的小型底栖鲨鱼，因其性情温顺，便于饲养，是近年来单域抗体(Single domain antibody)研究领域的重要实验动物。条纹斑竹鲨来源的单个核细胞是研究鲨鱼免疫响应过程及鲨源单域抗体的必要原材料。
[0003]在现有的技术体系中，使用以ficoll为主要分离液成分的密度梯度离心法是分离单个核细胞的重要手段，因其操作简单，商业化试剂成熟而被广泛应用于各种动物的研究当中。条纹斑竹鲨属于海洋软骨鱼类，与哺乳动物及常见硬骨鱼的单个核细胞密度都不同，使用常规市售的海水鱼外周血淋巴细胞分离液及人源外周血单个核细胞分离液(密度：1.077g/ml)并不能将条纹斑竹鲨的单个核细胞与红细胞、粒细胞分开，可能原因是这些试剂盒中的分离液密度、缓冲体系与条纹斑竹鲨这一物种并不适配，并且市面上尚无专门针对条纹斑竹鲨的单个核细胞分离的试剂盒。目前，在分离出高纯度的条纹斑竹鲨单个核细胞的过程上面临着巨大的技术障碍。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的是为了解决现有外周血单个核细胞分离技术无法实现条纹斑竹鲨的单个核细胞分离问题，提供一种适用于条纹斑竹鲨的单个核细胞分离的稀释液及方法，能够将条纹斑竹鲨的单个核细胞与红细胞、粒细胞分开，并且分离得到的单个核细胞中活细胞比例较高。
[0005]本专利技术解决其技术问题采用的其中一种技术方案是：一种鲨鱼稀释液，该鲨鱼稀释液包括PBS缓冲液及尿素，其密度为1.0028g/mL
‑
1.0235g/mL。
[0006]进一步优选地，所述鲨鱼稀释液通过以下方法制备：
[0007]取100mL 10
×
PBS缓冲液、尿素、NaCl，加入超纯水定容至1L，使尿素终浓度为100mM
‑
300mM，NaCl终浓度为50mM。
[0008]本专利技术进一步提供一种鲨鱼稀释液的用途，该鲨鱼稀释液用于分离鲨鱼的单个核细胞，或者用于制备鲨鱼单个核细胞分离液或试剂盒。
[0009]本专利技术进一步提供一种鲨鱼单个核细胞分离液，该分离液是采用所述的鲨鱼稀释液稀释人源外周血单个核细胞分离液试剂而得到；人源外周血单个核细胞分离液试剂与鲨鱼稀释液体积比在58∶42
‑
70∶30之间。
[0010]本专利技术进一步提供一种鲨鱼单个核细胞分离试剂盒，该试剂盒包括所述的鲨鱼稀释液；或者所述的鲨鱼单个核细胞分离液。
[0011]本专利技术进一步提供一种条纹斑竹鲨单个核细胞的分离方法，包括以下步骤：
[0012](1)获取新鲜的、抗凝处理的条纹斑竹鲨外周血或经预处理的新鲜组织，低温离心后，取血细胞或组织细胞使用所述的鲨鱼稀释液进行充分稀释，制备细胞悬液，并恢复至室温；
[0013](2)使用所述的鲨鱼稀释液稀释常规市售的人源外周血单个核细胞分离液试剂，获得条纹斑竹鲨单个核细胞分离液；
[0014](3)在离心管中添加不少于3mL步骤(2)得到的条纹斑竹鲨单个核细胞分离液，并在上方缓慢添加步骤(1)获得的细胞悬液；
[0015](4)室温，1000
×
g下离心30min；弃去上层稀释液层，收取中间的白膜层至另一离心管中；白膜层即为分离出的单个核细胞；
[0016](5)使用所述的鲨鱼稀释液对分离出来的单个核细胞进行清洗，于300
×
g，离心10min收集细胞沉淀；
[0017](6)重复上述的清洗步骤；
[0018](7)重悬沉淀细胞即获得分离后的鲨鱼单个核细胞悬液。
[0019]进一步优选地，所述步骤(1)中的细胞悬液稀释倍数在2
‑
3倍。
[0020]进一步优选地，所述步骤(2)中，人源外周血单个核细胞分离液试剂与鲨鱼稀释液的体积比在58∶42
‑
70∶30之间。
[0021]进一步优选地，所述步骤(2)中得到的鲨鱼单个核细胞分离液的密度为1.049g/mL
‑
1.058g/mL。
[0022]现有技术相比，本专利技术具有的有益效果是：本专利技术基于现有的密度梯度离心技术，提供一种适用于鲨鱼单个核细胞分离的鲨鱼稀释液，并且调整了鲨鱼稀释液中尿素浓度，无需完全模仿鲨鱼血液缓冲组分，即可克服分离该物种单个核细胞过程中，由于细胞密度、渗透压变化、缓冲条件不适等导致的细胞死亡或分离效果不佳的问题。本专利技术建立了一种从鲨鱼外周血或组织中分离单个核细胞的方法，不仅能够有效地降低红细胞或粒细胞的污染，使获得的单个核细胞具有较高的活性和纯度。同时本专利技术提供的鲨鱼稀释液及试剂盒填补了市面上相关产品的空白。
附图说明
[0023]图1为使用海水鱼外周血单个核细胞分离液对条纹斑竹鲨外周血处理后的单个核细胞分离效果示意图；(A)为操作步骤及每一层成分示意图；(B)为实际分离效果示意图；
[0024]图2为通过调整海水鱼外周血单个核细胞分离试剂盒提到的可调离心参数后的分离情况；(A)调整离心力；(B)调整离心时间；
[0025]图3为使用本专利技术的方法对条纹斑竹鲨外周血处理后的单个核细胞分离效果示意图；
[0026]图4为使用本专利技术的方法对条纹斑竹鲨外周血(A)及脾脏组织(B)处理后的单个核细胞分离效果实际情况；
[0027]图5为使用显微镜观察本专利技术鲨鱼稀释液中做不同尿素浓度调整时经台盼蓝染色后的血细胞情况；(A)尿素终浓度0Mm；(B)尿素终浓度200mM；(C)：尿素终浓度1M。
具体实施方式
[0028]为了便于理解本专利技术，下面结合附图和具体实施例，对本专利技术进行更详细的说明。附图中给出了本专利技术的较佳的实施例。但是，本专利技术可以以许多不同的形式来实现，并不限于本说明书所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本专利技术公开内容的理解更加透彻全面。
[0029]条纹斑竹鲨属于海洋软骨鱼类，是近年来单域抗体研究领域的重要实验动物。条纹斑竹鲨来源的单个核细胞是研究鲨鱼免疫响应过程及鲨源单域抗体方面不可缺少的原材料。
[0030]由于市面上尚无专门针对条纹斑竹鲨的单个核细胞分离的试剂盒，所以本专利技术的专利技术人首先尝试使用了市售的海水鱼外周血单个核细胞分离液，按照说明书中的操作步骤如图1中(A)所示，却发现该分离液并不能将条纹斑竹鲨的单个核细胞与红细胞、粒细胞分开，如图1中(B)所示。在按照商品说明书进行处理鲨鱼的外周血后，所有的血细胞都处于分离液的上层，红细胞和粒细胞层紧贴着单个核细胞层，此时的分离液完全没起到分离出单个核细胞的作用。
[0031]此后，根据上述本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种鲨鱼稀释液，其特征在于：该鲨鱼稀释液包括PBS缓冲液及尿素，其密度为1.0028 g/mL
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1.0235 g/mL。2.根据权利要求1所述的鲨鱼稀释液，其特征在于，所述鲨鱼稀释液通过以下方法制备：取100 mL10
×
PBS缓冲液、尿素、NaCl，加入超纯水定容至1 L，使尿素终浓度为100 mM
ꢀ‑ꢀ
300 mM，NaCl终浓度为50 mM。3.一种如权利要求1或2所述的鲨鱼稀释液的用途，其特征在于：用于分离鲨鱼的单个核细胞，或者用于制备鲨鱼单个核细胞分离液或试剂盒。4.一种鲨鱼单个核细胞分离液，其特征在于：该分离液是采用如权利要求1或2所述的鲨鱼稀释液稀释人源外周血单个核细胞分离液试剂而得到；人源外周血单个核细胞分离液试剂与鲨鱼稀释液体积比在58 : 42
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70 : 30之间；该分离液密度为1.049 g/mL
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1.058 g/mL。5.一种鲨鱼单个核细胞分离试剂盒；其特征在于：包括如权利要求1或2中所述的鲨鱼稀释液。6.一种鲨鱼单个核细胞分离试剂盒；其特征在于：包括如权利要求4所述的鲨鱼单个核细胞分离液。7.一种鲨鱼单个核细胞的分离方法，其特征在于：该方法使用如权利要求1或2所述的鲨鱼稀释液，包括以下步骤：（1）获取新鲜的、抗凝处理的鲨鱼外周血或经预...

【专利技术属性】
技术研发人员：毕允晨，邓鹏辉，闻建晴，王淏，
申请(专利权)人：中国科学院海洋研究所，
类型：发明
国别省市：