一种共培养巨噬细胞和肝癌细胞的体系和方法技术

本发明专利技术提供了一种共培养巨噬细胞和肝癌细胞的体系和方法，包括以下步骤：1，取RH35细胞培养基与NR8383细胞培养基按比例1:1

【技术实现步骤摘要】
一种共培养巨噬细胞和肝癌细胞的体系和方法


[0001]本专利技术涉及细胞培养
，尤其涉及一种共培养巨噬细胞和肝癌细胞的体系和方法。

技术介绍

[0002]原发性肝癌是世界上第5位最常见的恶性肿瘤，预后差，病死率高，为第二常见的引起肿瘤相关性死亡的原因。基于中国肿瘤登记中心数据库72个登记点(2009～2011年)数据显示：我国60岁以下男性中，肝癌是最常见和死亡率最高的恶性肿瘤。在我国，导致肝癌发生的主要原因是乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)的感染，慢性酒精性肝炎等。由于慢性炎症导致了不可逆转的肝组织损伤，并最终导致了肝癌的发生。肝癌具有早期诊断率低、恶性程度高、易转移、常常合并肝硬化等特点，早期肝癌患者可以采取手术切除、肝移植、局部物理治疗等治疗方法，而对于晚期肝癌患者和术后复发的患者来说，系统治疗只能使有限的患者受益，术后5年复发率高达70％。当前以手术切除为主的临床治疗手段反应差，因而致残、致死率高。为改变当前肝癌的预后，深入研究肝癌分子发病机制，探索新的有效治疗方法，从而对使更多进展期肝癌患者和术后复发患者获益具有重要的意义。
[0003]肝癌是经典的炎症相关性癌症，肝癌预后较差的原因是因为其极易侵袭、转移。随着研究的不断深入，学者发现存在于肿瘤微环境中的巨噬细胞在肝癌的发生、发展中起了重要作用，巨噬细胞参与上皮间质转化、促进血管生成参与肿瘤细胞的侵袭和转移。肿瘤相关巨噬细胞是肝癌微环境中主要的炎症细胞，大量研究表明：肿瘤间质中的巨噬细胞在肿瘤的发生和演变过程中起重要作用。近年来随着人们对肿瘤研究的不断深入，发现肿瘤细胞并非肿瘤组织中的唯一成分，其形成与演变不仅与肿瘤细胞本身相关，还与微环境有关。肿瘤微环境在肿瘤的演变过程中起重要作用，是决定肿瘤细胞行为的关键因素。巨噬细胞是肿瘤免疫微环境中的主要组成。有研究指出肿瘤间质中的巨噬细胞能够通过分泌一些特殊的细胞因子，促进肿瘤细胞的增殖和转移能力，诱导肿瘤新生血管和淋巴管生成，抑制机体免疫反应，进而促进肿瘤复发和转移。
[0004]有研究证实，肝癌细胞对肿瘤相关巨噬细胞具有非常活跃的招募功能，并且能使M1细胞向M2细胞转换。有病理结果研究显示，肿瘤相关巨噬细胞的密度越高，患者的预后越差。巨噬细胞是一种高度可塑的细胞，可以被极化以获得一系列功能性表型。为了应对微环境中的刺激，巨噬细胞可以在表型上极化为两个主要细胞群：M1型巨噬细胞主要表现为杀伤肿瘤，促进炎性反应的活性；而M2型巨噬细胞主要表现为抗炎症，促进肿瘤的活性。而肿瘤周围的肿瘤相关巨噬细胞往往表现为M2型。肿瘤细胞都能以某种方式促进M2型巨噬细胞的极化，从而促进肿瘤的发生、发展。有研究证明，在肿瘤细胞的背景下，肿瘤微环境中的肿瘤相关巨噬细胞通常促进癌细胞增殖、免疫抑制和血管生成，以支持肿瘤的生长和转移。在促进肿瘤增殖、侵袭和转移方面，巨噬细胞(主要是M2型巨噬细胞)都发挥着巨大的作用。
[0005]肝癌细胞或肝癌起始细胞发出信号吸引外周血中的单核细胞围绕自身进行聚集，此时单核细胞就转变为肿瘤相关巨噬细胞。肝癌细胞通过各种机制诱导肿瘤相关巨噬细胞
向着促瘤的M2型巨噬细胞极化。被诱导了的巨噬细胞又通过分泌细胞因子或者表面分子相互作用等机制促进肿瘤细胞的增殖、侵袭和转移。这在肝肿瘤细胞与巨噬细胞之间形成了一个正反馈环，共同促进肿瘤的发生、生长和转移。在病毒性肝炎免疫耐受期时，病毒和免疫系统达到一种病理下平衡；而当免疫激活时，肝内巨噬细胞和T细胞清除被病毒感染的肝细胞发生肝炎；慢性、持续性炎症的发展，激活肝脏内在免疫反应，释放多种细胞因子包括：肿瘤坏死因子α、白介素6、白介素10等；驻留肝内的巨噬细胞(Kupffer细胞)和招募而来的巨噬细胞，在炎症微环境下，出现M1/M2型转化，向M2型巨噬细胞分化，部分M2型巨噬细胞转变为肿瘤相关巨噬细胞；同时损伤肝内卵圆细胞增殖，而增殖的卵圆细胞在分化成熟的过程中，细胞周围微环境决定了它的命运；不良微环境，如Th1型细胞因子减少，Th2型细胞因子为主，以及富含肿瘤相关巨噬细胞的微环境，和/或内源性调控机制异常，可能使成熟前、各阶段的卵圆细胞内原癌基因活化、抑癌基因失活，激活细胞增殖信号通路，如Wnt/β
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catenin通路异常活化，进而启动肝癌发生。
[0006]总之，巨噬细胞在肝癌发生发展过程中起着至关重要的作用。因此，将巨噬细胞和肝癌细胞共培养，对于研究巨噬细胞活化的异常炎症环境与肝癌之间的关系，以及明确“炎
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癌”过程中细胞微环境状况等均具有十分重要的意义。

技术实现思路

[0007]本专利技术针对现有技术的不足，提供了一种共培养巨噬细胞和肝癌细胞的体系和方法。
[0008]为实现上述目的，本专利技术采用以下技术方案：
[0009]第一方面，本专利技术提供了一种共培养巨噬细胞和肝癌细胞的体系，包括胎牛血清、Ham's F
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12K基础培养基和DMEM高糖培养基。
[0010]进一步地，上述体系包括含20％胎牛血清的Ham's F
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12K基础培养基和含10％胎牛血清的DMEM高糖培养基。
[0011]进一步地，上述含20％胎牛血清的Ham's F
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12K基础培养基和含10％胎牛血清的DMEM高糖培养基的体积比为1:8～1:1，优选为1:1。
[0012]进一步地，上述巨噬细胞为NR8383细胞；上述肝癌细胞为RH35细胞。
[0013]第二方面，本专利技术提供上述体系的构建方法，包括如下步骤：
[0014]步骤一，将上述20％胎牛血清的Ham's F
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12K基础培养基和含10％胎牛血清的DMEM高糖培养基按照不同的体积比进行混合配制共培养体系，接种巨噬细胞或肝癌细胞；
[0015]步骤二，培养24小时后采用MTT法、钙黄绿素染色、细胞凋亡流式检测测定细胞的活力、死亡率或凋亡率，比较各个体积比下共培养体系中的巨噬细胞或肝癌细胞的活力、死亡率或凋亡率，选择最佳的体积比。
[0016]进一步地，步骤一中接种的巨噬细胞或肝癌细胞处于对数生长期。
[0017]进一步地，上述构建方法还包括设置对照组和空白组；相对于肝癌细胞，该对照组为含10％胎牛血清的DMEM高糖培养基中接种的肝癌细胞组，空白组为不含细胞的DMEM高糖培养基组；针对巨噬细胞，该对照组为20％胎牛血清的Ham's F
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12K基础培养基中接种的巨噬细胞组，空白组为不含细胞的Ham's F
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12K基础培养基组。
[0018]进一步地，步骤二中采用的MTT浓度为0.5％。
[0019]第三方面，本专利技术提供了一种共培养巨噬细胞和肝癌细胞的方法，包括将巨噬细胞和肝癌细胞同时接种于上述体系进行培养。
[0020]进一步地，上述巨噬细胞为NR8383细胞；上述肝癌细胞为RH35细胞。
[0021]进一步地，共培养的条件为37℃，5％CO2的细胞培本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种共培养巨噬细胞和肝癌细胞的体系，其特征在于，包括胎牛血清、Ham'sF
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12K基础培养基和DMEM高糖培养基。2.根据权利要求1所述的体系，其特征在于，所述体系包括含20％胎牛血清的Ham's F
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12K基础培养基和含10％胎牛血清的DMEM高糖培养基。3.根据权利要求2所述的体系，其特征在于，所述含20％胎牛血清的Ham's F
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12K基础培养基和含10％胎牛血清的DMEM高糖培养基的体积比为1:8～1:1，优选为1:1。4.根据权利要求1所述的体系，其特征在于，所述巨噬细胞为NR8383细胞；所述肝癌细胞为RH35细胞。5.一种如权利要求1
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4任一项所述体系的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤一，将上述20％胎牛血清的Ham's F
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12K基础培养基和含10％胎牛血清的DMEM高糖培养基按照不同的体积比进行混合配制共培养体系，接种巨噬细胞或肝癌细胞；步骤二，培养24小时后采用MTT法、钙黄绿素染色、细胞凋亡流式检测测...

【专利技术属性】
技术研发人员：羊东晔，刘冬萌，郭嘉琪，周丽诗，符艳秋，李玉林，
申请(专利权)人：香港大学深圳医院，
类型：发明
国别省市：