一种获得抗原特异性T细胞的方法技术

本发明专利技术公开了一种获得抗原特异性T细胞的方法，包括如下步骤：步骤一，采集外周血，分离获得单个核细胞PBMC；步骤二，获取未成熟DC细胞；步骤三，刺激诱导未成熟DC细胞成熟；步骤四，分离纯化初始T细胞；步骤五，按照成熟DC细胞：初始T细胞＝1：5

【技术实现步骤摘要】
一种获得抗原特异性T细胞的方法


[0001]本专利技术涉及细胞生物学领域，特别是一种获得抗原特异性T细胞的方法。

技术介绍

[0002]目前常用获得抗原特异性T细胞的方法主要是从外周血中分离单个核细胞(Peripheral Blood Mononuclear Cell，缩写PBMC)后，将其加入适量培养基后在培养箱中孵育2h，其中所有贴壁细胞被认为是未成熟DC细胞，悬浮细胞被认为是T细胞；将悬浮细胞通过收集洗涤后作为T细胞保存；将目标抗原与贴壁细胞(未成熟DC细胞)共孵育，并通过添加多种细胞因子诱导未成熟DC细胞成熟；然后再将得到的成熟DC细胞与之前收集的T细胞共培养，获得抗原特异性T细胞。但是此方法获得的贴壁细胞仍含有T细胞，从而直接导致得到的成熟DC细胞的纯度低、数量少。且目前通常成熟DC细胞与T细胞仅共培养刺激一轮，使用的是未经纯化的T细胞，其中初始T细胞含量低、纯度不高。但是由于能被成熟DC细胞激活并接收成熟DC细胞所提呈的抗原信息的是初始T细胞，所以在初始T细胞含量低、纯度不高的情况下，最终很难在共培养成熟的DC细胞和未经纯化的T细胞后得到的细胞悬液中有效获得抗原特异性T细胞。因此，市场需要一种能够更有效地获得抗原特异性T细胞的方法，本专利技术解决这样的问题。

技术实现思路

[0003]为解决现有技术的不足，本专利技术的目的在于提供一种获得抗原特异性T细胞的方法，采用本方法能有效提高共培养细胞悬液中抗原T细胞占比。
[0004]为了实现上述目标，本专利技术采用如下的技术方案：
>[0005]一种获得抗原特异性T细胞的方法，包括如下步骤：
[0006]步骤一，采集外周血，分离获得单个核细胞PBMC；
[0007]步骤二，获取未成熟DC细胞：
[0008]将PBMC离心弃上清，采用免疫磁珠分离试剂盒分离获得未成熟DC细胞，加入缓冲液和免疫磁珠，混匀后避光孵育；再经过多次离心、弃上清，计数重悬；将细胞悬液经分离柱洗脱分离得到未成熟DC细胞和T细胞；
[0009]步骤三，刺激诱导未成熟DC细胞成熟：
[0010]收集未成熟DC细胞，铺入培养瓶，加DC细胞培养基培养后，加入抗原，再加入生长因子组合；培养后收集成熟DC细胞；
[0011]步骤四，分离纯化初始T细胞：
[0012]将步骤二得到的T细胞计数，采用免疫磁珠分离试剂盒分离获得初始T细胞，加入缓冲液和免疫磁珠，混匀后避光孵育；再经过多次离心、弃上清，计数重悬；将细胞悬液经分离柱洗脱分离得到非初始T细胞和初始T细胞；
[0013]将初始T细胞接种后加入T细胞维持培养基后培养；待收集完步骤三中成熟DC细胞后，再次对培养后的初始T细胞进行计数；
[0014]步骤五，共刺激培养激活抗原特异性T细胞：
[0015]共刺激培养的方法为：按照成熟DC细胞：初始T细胞＝1：5
‑
120的细胞数量比例混合，加入5
‑
240μg/ml的抗原，共刺激培养；将成熟DC细胞与初始T细胞共刺激培养1
‑
3轮，在最后1轮加入成熟DC细胞和抗原后继续培养5
‑
128h，得到细胞悬液；
[0016]步骤六，分离纯化抗原特异性T细胞：
[0017]共刺激培养后的细胞悬液进行计数离心弃上清，采用免疫磁珠分离试剂盒分离纯化抗原特异性T细胞，加入缓冲液和免疫磁珠，混匀后避光孵育；再经过多次离心、弃上清，计数重悬；将细胞悬液经分离柱洗脱分离得到非抗原特异性T细胞和抗原特异性T细胞。
[0018]前述的一种获得抗原特异性T细胞的方法，步骤二中使用的免疫磁珠分离试剂盒为：CD14免疫磁珠分离试剂盒、阴选单核细胞免疫磁珠分离试剂盒或经典单核细胞免疫磁珠分离试剂盒中的任意一种。
[0019]前述的一种获得抗原特异性T细胞的方法，步骤三中的DC细胞培养基由在AIM
‑
V中加入500～1000U/ml IL
‑
4、500～1000U/ml GM
‑
CSF和1～5％自体血浆组成。
[0020]前述的一种获得抗原特异性T细胞的方法，步骤三中的生长因子组合由500～1000U/ml TNF
‑
α、5～10ng/ml IL
‑
6、5～10ng/ml IL
‑
1β、0.5～2μg/ml PGE
‑
2和0.5～2μg/mlα4
‑
1BB
×
CD40L双特异性抗体组成。
[0021]前述的一种获得抗原特异性T细胞的方法，步骤四中T细胞维持培养基由在AIM
‑
V中加入1～5％自体血浆和10～50ng/ml IL
‑
7组成。
[0022]前述的一种获得抗原特异性T细胞的方法，步骤四中使用的免疫磁珠分离试剂盒为：CD45RA免疫磁珠分离试剂盒或阴选初始T细胞免疫磁珠分离试剂盒中的任意一种。
[0023]前述的一种获得抗原特异性T细胞的方法，步骤五中的共刺激培养的方法为：按照成熟DC细胞：初始T细胞＝1：80的细胞数量比例混合，加入25μg/ml的抗原，共刺激培养；将成熟DC细胞与初始T细胞共刺激培养3轮，在最后1轮加入成熟DC细胞和抗原后继续培养32h，得到细胞悬液。
[0024]前述的一种获得抗原特异性T细胞的方法，步骤六中使用的免疫磁珠分离试剂盒为：PD
‑
1免疫磁珠分离试剂盒、CD134免疫磁珠分离试剂盒、CD69免疫磁珠分离试剂盒、CD107a免疫磁珠分离试剂盒、CD25免疫磁珠分离试剂盒或4
‑
1BB免疫磁珠分离试剂盒中的任意一种。
[0025]本专利技术的有益之处在于：
[0026]本专利技术在进行成熟DC细胞与T细胞共刺激培养步骤之前，先通过初始T细胞特异性标记物CD45RA对应的免疫磁珠分选T细胞，获得了高纯度的初始T细胞，再将成熟DC细胞与这些分选后获得的初始T细胞进行共刺激培养，从而显著提升了成熟DC细胞激活并提呈目标抗原信息给初始T细胞的效率，进而提升目标抗原特异性T细胞的产量；
[0027]本专利技术改进了共刺激培养的方法，按照成熟DC细胞：初始T细胞＝1：5
‑
120的细胞数量比例混合，分1
‑
3轮刺激初始T细胞，从而既保证有数量充足的成熟DC细胞可用于共刺激培养，又提升了能识别目标抗原信息的初始T细胞获得被成熟DC细胞提呈的目标抗原信息的效率，进而提升目标抗原特异性T细胞的产量；
[0028]本专利技术使用的T细胞维持培养基是在基础培养基的基础上添加了2％自体血浆和20ng/ml IL
‑
7，另又加入抗原5
‑
240μg/ml，可有效提升抗原特异性T细胞在最终得到的细胞
悬液中的占比，即可有效提升目标抗原特异性T细胞的产量；
[0029]本专利技术将成熟DC细胞和5
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种获得抗原特异性T细胞的方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤一，采集外周血，分离获得单个核细胞PBMC；步骤二，获取未成熟DC细胞：将PBMC离心弃上清，采用免疫磁珠分离试剂盒分离获得未成熟DC细胞，加入缓冲液和免疫磁珠，混匀后避光孵育；再经过多次离心、弃上清，计数重悬；将细胞悬液经分离柱洗脱分离得到未成熟DC细胞和T细胞；步骤三，刺激诱导未成熟DC细胞成熟：收集未成熟DC细胞，铺入培养瓶，加DC细胞培养基培养后，加入抗原，再加入生长因子组合；培养后收集成熟DC细胞；步骤四，分离纯化初始T细胞：将步骤二得到的T细胞计数，采用免疫磁珠分离试剂盒分离获得初始T细胞，加入缓冲液和免疫磁珠，混匀后避光孵育；再经过多次离心、弃上清，计数重悬；将细胞悬液经分离柱洗脱分离得到非初始T细胞和初始T细胞；将初始T细胞接种后加入T细胞维持培养基后培养；待收集完步骤三中成熟DC细胞后，再次对培养后的初始T细胞进行计数；步骤五，共刺激培养激活抗原特异性T细胞：共刺激培养的方法为：按照成熟DC细胞：初始T细胞＝1：5
‑
120的细胞数量比例混合，加入5
‑
240μg/ml的抗原，共刺激培养；将成熟DC细胞与初始T细胞共刺激培养1
‑
3轮，在最后1轮加入成熟DC细胞和抗原后继续培养5
‑
128h，得到细胞悬液；步骤六，分离纯化抗原特异性T细胞：共刺激培养后的细胞悬液进行计数离心弃上清，采用免疫磁珠分离试剂盒分离纯化抗原特异性T细胞，加入缓冲液和免疫磁珠，混匀后避光孵育；再经过多次离心、弃上清，计数重悬；将细胞悬液经分离柱洗脱分离得到非抗原特异性T细胞和抗原特异性T细胞。2.根据权利要求1所述的一种获得抗原特异性T细胞的方法，其特征在于，所述步骤二中使用的免疫磁珠分离试剂盒为：CD14免疫磁珠分离试剂盒、阴选单核细胞免疫磁珠分离试剂盒或经典单核细胞免疫磁珠分离试剂盒中的任意一种。3.根据权利要求1所述的一种获得抗原特异性T细胞的方法，其特征在于，所述步骤三中的D...

【专利技术属性】
技术研发人员：韩宁，张凡，
申请(专利权)人：杭州芯递力生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：