一种刺激细胞快速分泌外泌体的方法及其应用技术

本发明专利技术公开了一种刺激细胞快速分泌外泌体的方法，包括以下步骤：装载声敏剂：对细胞装载声敏剂，得到装有声敏剂的细胞；超声波辐照：待细胞将声敏剂吸收或转化后进行低频超声波辐照；收集细胞上清液：收集步骤(2)中经低频超声波辐照后的细胞的上清液；外泌体的提取与纯化：将步骤(3)中得到的细胞上清液经超速离心法去除死亡细胞和调亡小体，再进行提取与纯化，得到外泌体。本发明专利技术还公开了刺激细胞快速分泌外泌体的方法制备得到的物质，在制备细胞调节基因表达、免疫治疗药物中的应用。本发明专利技术采用声敏剂联合超声波产生声动力作用的方法，作用于细胞，促使细胞产生和释放更多的外泌体。体。体。

【技术实现步骤摘要】
一种刺激细胞快速分泌外泌体的方法及其应用


[0001]本专利技术涉及生物医药
，具体涉及到一种刺激细胞快速分泌外泌体的方法及其应用。

技术介绍

[0002]外泌体是由细胞释放到细胞外液中的直径约为40
‑
160nm的生物活性囊泡，可高效地传递生物活性物质参与细胞代谢、组织修复、免疫调控等关键过程，在缓解炎症、心血管疾病、肿瘤等治疗领域具有巨大的应用潜力。外泌体治疗具有独特优势：无复制功能故无成瘤风险；高递送效率且有过滤杀菌作用；体积小易通过体内循环到达损伤部位；更低的免疫源性和良好的生物相容性；可保护其携带的微小核糖核酸(miRNA)免受RNA酶降解,使其可以相对较长时间稳定的表达并行使调控作用，从而抑制血管形成达到控制疾病进展或组织修复的目的。
[0003]目前临床尚无有效促进外泌体分泌的药物和方法。最新的3D培养技术可优化外泌体产量及功能，但无法在人体上实施，其临床应用前景渺茫。缺氧预处理是最常用的促进外泌体分泌的手段，然而，当体内氧饱和度降低到一定水平时会导致细胞发生应激反应，干扰细胞的正常功能，无法维持良好细胞状态。药物刺激预处理也存在药物不适配患者的病情，甚至增加不良反应的弊端。因此，开发可获得更高质量的临床适用性外泌体的新方法是当务之急，具有深远、重要的意义。
[0004]专利201910567977.4公开了一种低强度脉冲超声刺激促进细胞外泌体分泌的方法，该专利技术是通过低强度脉冲超声刺激促进细胞外泌体分泌，解决传统依靠细胞分泌外泌体产量低的问题。该专利只公开了如何提高细胞分泌的外泌体量，并没有公开如何使细胞在短时间内产生并释放外泌体。
[0005]现有技术中，没有文献公开过如何使细胞在短时间内产生并释放大量外泌体，本专利技术公开了一种刺激细胞快速分泌外泌体的方法及其应用，通过声敏剂与超声波协同产生的声动力作用使细胞在短时间内产生并释放外泌体，并且得到的外泌体中包含了更多具有治疗动脉粥样硬化斑块作用的微小核糖核酸，从而稳定动脉粥样硬化斑块。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的是提供一种刺激细胞快速分泌外泌体的方法及其应用，用于解决现有技术中如何使细胞在短时间内产生并释放外泌体的技术问题。
[0007]为达上述目的，本专利技术的一个实施例中提供了一种刺激细胞快速分泌外泌体的方法，包括以下步骤：
[0008]步骤(1)装载声敏剂：对细胞装载声敏剂，得到装有声敏剂的细胞；
[0009]步骤(2)超声波辐照：待细胞将声敏剂吸收或转化后进行低频超声波辐照；
[0010]步骤(3)收集细胞上清液：收集步骤(2)中经低频超声波辐照后的细胞的上清液；
[0011]步骤(4)外泌体的提取与纯化：将步骤(3)中得到的细胞上清液经超速离心法去除
死亡细胞和调亡小体，再进行提取与纯化，得到外泌体。
[0012]本专利技术优选的方案之一，步骤(1)中声敏剂为具有声敏性的药物或者具有声敏性的药物的前体药物。
[0013]本专利技术优选的方案之一，步骤(1)中细胞为原代培养巨噬细胞，声敏剂为华卟啉钠。
[0014]本专利技术优选的方案之一，步骤(1)具体为：向培养成熟的巨噬细胞中加入0.75μM
‑
0.85μM的华卟啉钠，在温度为37℃，5％CO2环境中孵育5.5h
‑
6.5h。
[0015]本专利技术优选的方案之一，低频超声波辐照的超声参数为：超声频率0.5MHz
‑
1.5MHz，超声强度0.01W/cm2‑
0.5W/cm2，占空比5％
‑
15％，辐照时间2min
‑
8min。
[0016]本专利技术优选的方案之一，步骤(2)中得到的经低频超声波辐照后的细胞的上清液需静置1.8h
‑
2.2h后再收集其上清液。
[0017]本专利技术优选的方案之一，步骤(3)具体为：使用移液管吸取细胞上清，转移至无菌无RNA酶的离心管中。
[0018]本专利技术优选的方案之一，步骤(4)具体为：将步骤(3)中离心管中的细胞上清液在4℃、2000g下离心15min
‑
30min，去除死亡细胞，取离心后的上清液在离心力10000g下离心25min
‑
35min，去除调亡小体，再取离心后的上清液在离心力100000g下离心50min
‑
70min，取离心后的沉淀溶于PBS缓冲液中，在离心力100000g下离心50min
‑
70min，获得的沉淀为外泌体。
[0019]本专利技术优选的方案之一，步骤(4)具体为：将步骤(3)中离心管中的细胞上清液在4℃、2000g下离心15min
‑
30min，去除死亡细胞，取离心后的上清液在离心力10000g下离心25min
‑
35min，去除调亡小体，再取离心后的上清液在离心力100000g下离心50min
‑
70min，取离心后的沉淀重悬于PBS缓冲液中。
[0020]本专利技术还公开了刺激细胞快速分泌外泌体的方法制备得到的物质，在细胞调节基因表达、免疫治疗中的应用。
[0021]综上所述，本专利技术的有益效果为：
[0022]1、本专利技术采用声敏剂联合超声波产生声动力作用的方法，作用于细胞，促使细胞产生和释放更多的外泌体，同时得到的外泌体中包含了更多具有生物活性及治疗作用的miRNAs，从而起到稳定动脉粥样硬化斑块、减轻炎症的作用。
[0023]2、体内外结果表明，本专利技术采用声敏剂联合超声波产生声动力作用的方法具有在短时间内产生和释放大量外泌体的效应，且低频超声波辐射安全可控性强，对正常局部组织及细胞影响极其小，不会干扰细胞正常的功能，具有广阔的临床应用前景。
[0024]3、本专利技术具体涉及一种基于SDT介导的外泌体疗法，为减轻炎症、肿瘤、心血管等治疗领域开辟了新的途径。
附图说明
[0025]图1为本专利技术一个实施例与对比例的外泌体的电镜代表图；
[0026]图2为本专利技术一个实施例与对比例的外泌体的粒径分布图；
[0027]图3为本专利技术一个实施例与对比例的外泌体的生物标志物表达情况图；
[0028]图4为本专利技术一个实施例与对比例的外泌体内含物的差异miRNA图；
[0029]图5为本专利技术一个实施例与对比例的外泌体部分miRNA差异表达热图；
[0030]图6为本专利技术一个实施例与对比例的外泌体与动脉粥样硬化斑块关系图；
[0031]图7为本专利技术一个实施例与对比例的外泌体被内皮细胞摄取图。
具体实施方式
[0032]实施例1
[0033]本专利技术提供了一种刺激细胞快速分泌外泌体的方法，包括以下步骤：
[0034]步骤(1)装载声敏剂：向培养成熟的巨噬细胞中加入0.8μM的华卟啉钠，在温度为37℃，5％CO2环境中孵育6h；
[0035]步骤(2)超声波本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种刺激细胞快速分泌外泌体的方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤(1)装载声敏剂：对细胞装载声敏剂，得到装有声敏剂的细胞；步骤(2)超声波辐照：待细胞将声敏剂吸收或转化后进行低频超声波辐照；步骤(3)收集细胞上清液：收集步骤(2)中经低频超声波辐照后的细胞的上清液；步骤(4)外泌体的提取与纯化：将步骤(3)中得到的细胞上清液经超速离心法去除死亡细胞和调亡小体，再进行提取与纯化，得到外泌体。2.如权利要求1所述的刺激细胞快速分泌外泌体的方法，其特征在于：所述步骤(1)中声敏剂为具有声敏性的药物或者具有声敏性的药物的前体药物。3.如权利要求1所述的刺激细胞快速分泌外泌体的方法，其特征在于：所述步骤(1)中细胞为原代培养巨噬细胞，声敏剂为华卟啉钠。4.如权利要求3所述的刺激细胞快速分泌外泌体的方法，其特征在于：所述步骤(1)具体为：向培养成熟的巨噬细胞中加入0.75μM
‑
0.85μM的华卟啉钠，在温度为37℃，5％CO2环境中孵育5.5h
‑
6.5h。5.如权利要求1所述的刺激细胞快速分泌外泌体的方法，其特征在于：所述低频超声波辐照的超声参数为：超声频率0.5MHz
‑
1.5MHz，超声强度0.01W/cm2‑
0.5W/cm2，占空比5％
‑
15％，辐照时间2min
‑
8min。6.如权利要求1所述的刺激细胞快速分泌外泌体的方法，其特征在于：所述步骤(2)中得到的经低频超声波辐照后的细胞的上清液需静置1.8...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨阳，范长青，王嘉欣，曹长安，张昊亮，
申请(专利权)人：厦门大学附属翔安医院，
类型：发明
国别省市：